Evaluación del contenido proteico de vesículas extracelulares pequeñas derivadas de células de melanoma humano tratadas con Doxorrubicina

Abstract

Las Vesículas Extracelulares (EV) son estructuras membranosas liberadas al espacio extracelular, que transportan biomoléculas y permiten la modulación de microambientes locales y distantes. En particular las células cancerígenas liberan EV, incluyendo vesículas extracelulares pequeñas (sEV) como exosomas, que participan en la comunicación intercelular. Estudios in vitro han mostrado que el tratamiento con Doxorrubicina (Doxo) incrementa el nivel de secreción de sEV. Este agente quimioterapéutico puede inducir respuestas de estrés celular que alteran el microambiente tumoral y, además, se ha asociado con efectos secundarios como la cardiotoxicidad.

Este estudio evaluó el efecto de Doxo (10 nM) sobre la biogénesis, producción y contenido de sEV derivadas de células de melanoma humano A375, realizando un análisis multidimensional. A nivel intracelular, la inmunocitoquímica mostró un leve aumento en los marcadores característicos de sEV, destacándose especialmente CD81 a las 96 horas (p = 0,0083). Asimismo, se observó un incremento en las estructuras positivas relacionadas con como cuerpos multivesiculares y exosomas a las tinciones con naranja de acridina (A.O) y Bodipy-TR en células vivas a las 24 y 96 horas, respectivamente. Las sEV fueron aisladas del medio tras 48 horas de condicionamiento, utilizando cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). El análisis por seguimiento de nanopartículas evidenció un aumento significativo en la concentración de sEV (13,6 veces; p = 0,000014), acompañado de cambios en la distribución de tamaños en la población tratada (Doxo: 135,4± 5,60 nm). Mientras, la microscopía electrónica de barrido (SEM) mostró morfologías compatibles con un proceso de vesiculación activa. Por otro lado, la detección de citoquinas mediante un arreglo de anticuerpos indicó un aumento en los niveles de KITLG, CXCL1, CXCL12, CCL5, VEGF, IL-3, IL-4 e IL-10, siendo TGF-β la más destacada (p = 0,0134). El análisis bioinformático sugirió que algunas de las citoquinas encontradas en estas sEV podrían estar implicadas en la progresión tumoral y en efectos cardiotóxicos inducidos por el tratamiento.

En conjunto, los resultados evidenciaron que la exposición de células A375 a Doxo 10nM potencian la biogénesis y liberación de sEV, sugiriendo que la diseminación de sEV con elevado contenido de TGF-β puede contribuir a los efectos a nivel paracrino y autocrino en su microambiente, y a efectos secundarios atribuidos a la Doxo (Texto tomado de la fuente).

Extracellular Vesicles (EV) are membrane-bound structures released into the extracellular space that transport biomolecules and enable the modulation of local and distant microenvironments. Cancer cells actively secrete EV, including small extracellular vesicles (sEV) such as exosomes, which play a key role in intercellular communication. In vitro, studies have demonstrated that treatment with Doxorubicin (Doxo) leads to an increased secretion of sEV. This chemotherapeutic agent can induce cellular stress responses that alter the tumor microenvironment and has also been associated with side effects such as cardiotoxicity.

This study evaluated the effect of Doxo (10 nM) on biogenesis, production, and content of sEV derived from human melanoma A375 cells through multidimensional analysis. At the intracellular level, immunocytochemistry revealed a slight increase in characteristic sEV markers, with a notable rise in CD81 expression at 96 hours (p = 0.0083). Furthermore, an increased presence of structures associated with multivesicular bodies and exosomes was detected through acridine orange (A.O.) and Bodipy-TR staining in live cells at 24 and 96 hours, respectively. sEV were isolated from the conditioned medium after 48 hours using size-exclusion chromatography (SEC). Nanoparticle tracking analysis revealed a significant increase in sEV concentration (13.6 F.C; p = 0.000014), accompanied by changes in size distribution within the treated population (Doxo: 135.4 ± 5.60 nm). Meanwhile, scanning electron microscopy (SEM) showed morphologies consistent with active vesiculation. On the other hand, cytokine detection using an antibody array indicated increased levels of KITLG, CXCL1, CXCL12, CCL5, VEGF, IL-3, IL-4, and IL-10, with TGF-β being the most prominent (p = 0.0134). Bioinformatic analysis suggested that some of the cytokines in these sEV might be involved in tumor progression and Doxo-induced cardiotoxic effects.

Altogether, the results demonstrated that exposure of A375 cells to 10 nM Doxo enhances the biogenesis and release of sEV, suggesting that the dissemination of sEV with high TGF-β content may contribute to paracrine and autocrine effects within their microenvironment, as well as to side effects attributed to Doxo.