Evaluación in vitro de factores estimuladores e inhibidores de neuroregeneración presentes en cultivos celulares de la glía envolvente olfatoria

Abstract

Las células de la glía envolvente olfatoria (CGEO) son promotoras de la regeneración celular en el sistema nervioso debido a su inherente capacidad de fomentar la continua regeneración de neuronas olfatorias. Su mecanismo de acción se ha estudiado en modelos animales para favorecer la recuperación de la función locomotora en lesión medular. Estas células secretan proteínas como factores de crecimiento, factores proangiogénicos y angiogénicos, que ayudan a que ocurran procesos de neuroregeneración pero también factores que son inhibitorios de dichos procesos. Aunque se ha evaluado el efecto de estos factores en los procesos de neuroregeneración mediados por CGEO, no existen estudios en la literatura que cuantifiquen la concentración de los mismos en medios de cultivos celulares con el fin de identificar cuáles serían más idóneos como blancos terapéuticos en modelos experimentales de regeneración medular. La presente investigación tuvo como finalidad la evaluación cuantitativa (análisis estadístico) de la expresión in vitro de factores de crecimiento solubles promotores como factor de crecimiento fibroblástico ácido (aFGF), Neurotrofina-3 (NT-3) y Neurotrofina-4 (NT-4) así como de factores proteicos solubles inhibidores tales como glicoproteínas asociadas a la mielina MAG entre ellas NOGO-A, mediante el uso de una tecnología nanosensora, tanto en medios de cultivo como en CGEO en suspensión obtenidas de cultivos primarios de lámina propia (LP) y bulbo olfatorio (BO) de ratas Wistar neonatales y en CGEO transfectadas (TEG3), obtenidas de BO de ratas Wistar adultas. Los biosensores permitieron identificar que NT-3 fue el factor promotor en CGEO de LP con mayor concentración de 21,1 ug/mL en medios condicionados y 23,7 ug/mL en CGEO de BO como suspensión celular, mientras que el factor inhibidor con mayor concentración fue NOGO-A con 76,4 ug/mL en medios condicionados de LP y 125,5 ug/mL en CGEO de LP como suspensión celular. Los resultados mostraron para todas las concentraciones de los factores estimuladores e inhibidores una diferencia altamente significativa (p0.01) en medios condicionados entre las células de BO y de LP en relación al tiempo. Adicionalmente, en las CGEO como analito se encontró una diferencia significativa de (p0.05) en la expresión de NOGO-A , los demás factores presentaron concentraciones similares en ambos tipos celulares (LP y BO) con un (P0.05). Finalmente, en las TEG3 como analito NOGO-A tuvo una concentración de 3,35 ug/mL y el resto de factores presentó concentraciones muy bajas. De lo anterior se concluye que la potenciación de la NT-3 como factor estimulador y la modulación de NOGO-A como factor inhibidor, en CGEO obtenidas de LP y BO neonatales, serían objetivos terapéuticos idóneos en modelos experimentales de neuroregeneración.

Abstract. The olfactory ensheathing cells (OECs) are promoters of cell regeneration in the nervous system due to its inherent ability to support continuous regeneration of olfactory neurons. Its mechanism of action has been studied in animal models to assist the recovery of locomotive function in spinal cord injury. These cells secrete proteins such as growth factors, angiogenic and pro angiogenic factors, which help neuroregeneration processes to occur but they also secrete factors that are inhibitory to these processes. Although the impact of these factors on the neuroregeneration processes mediated by OECs has been assessed, there are no studies in the literature that quantify the concentration there of in cell cultures in order to identify which would be more suitable as therapeutic targets in experimental models for spinal cord regeneration. This research was aimed at the quantitative evaluation and in vitro expression of soluble growth factors promoters such as acidic fibroblast growth factor (aFGF), Neurotrophin-3 (NT-3) and Neurotrophin-4 (NT-4) as well as soluble protein inhibitor factors as myelin-associated glycoprotein MAG among them NOGO-A, using a Nano sensing technology, both in conditioned culture media as in a OECs suspension obtained from primary cultures of lamina propria and neonatal Wistar rat olfactory bulb and transfected OECs (TEG3) obtained from the olfactory bulb of adult Wistar rats. The biosensors allowed the identification of NT-3 as the promoter factor in OECs LP with the highest concentration (21,1 ug/mL in conditioned media and 23,7ug/mL in OECs as a cellular suspension), while the inhibitor factor with the highest concentration was NOGO-A (76,4 ug/mL in conditioned media in LP and 4,54 ug/mL in OECs as a LP cellular suspension). The results showed for all concentrations of the promoters and inhibitory factors a highly significant difference (p 0.01) between the cells conditioned BO and LP in relation to time. Additionally, in CGEO as analyte significant difference (p0.05) in the expression of NOGO-A, other factors had similar concentrations in both cell types (LP and BO) with a (P 0.05). Finally, as the analyte TEG3 NOGO-A had a concentration of 3.35 ug / mL and other factors presented very low concentrations. From the above it is concluded that the empowerment of NT-3 as stimulating factor and the modulation of NOGO-A inhibitor factor, in OECs obtained from neonatal lamina propria, would be ideal therapeutic targets in experimental models of neuroregeneration.