Comportamiento electrofisiológico en un sistema heterólogo de la proteína putativa codificada por el gen LbrM33 V2.1260 de Leishmania mediante la técnica patch clamp

Abstract

El género Leishmania está comprendido por parásitos unicelulares que son causantes de varias formas de leishmaniasis, un grupo de enfermedades con morbilidad y mortalidad significativas especialmente en países en desarrollo. Durante su ciclo de vida el parásito vive en ambientes cambiantes en composición iónica, pH, osmolaridad y temperatura, demandando del mismo su ajuste para garantizar el intercambio adecuado de nutrientes y mantener la homeostasis iónica. Se ha postulado como estrategia de supervivencia la ac-tividad de una proteína H+ATPasa que acoplada a una conductancia de cloruro generan una fuerza protón-motriz utilizada para concentrar glucosa y aminoácidos mientras regula pH. La naturaleza molecular de la conductancia aniónica es pobremente entendida. Tras la inyección de ARNm de Leishmania amazonensis y Leishmania braziliensis en ovocitos de anfibio, nuestro grupo identificó una corriente de cloruro voltaje dependiente generada por la inyección de material genético del parásito y que condujo a la búsqueda, identificación, clonación y caracterización de posibles transportadores aniónicos en Leishmania. En este trabajo se estudió la proteína putativa LbClC-D codificada por LbrM33_V2.1260. Utilizando cebadores específicos y mediante RT-PCR se obtuvo un amplicón del peso esperado de 2733 pb que se clonó en pGEM®-T Easy y se confirmó por secuenciación. La secuencia obtenida es 99,6 % idéntica a la reportada en bases de datos. El gen fue luego ligado al vector de expresión pmEGFP-1. El plásmido recombinante generado fue transfectado en células CHO y HEK293 sobre las cuales se realizaron registros de corriente de membrana en la modalidad de célula entera mediante la técnica patch clamp. La expresión de mEGFP se verificó por microscopía de epi-fluorescencia lo que sugiere expresión de la proteína de interés. La fluorescencia observada se localiza uniformemente en las células transfectadas. Se registraron pequeñas corrientes de salida no voltaje-dependientes de amplitud similar en células no transfectadas y transfectadas a pH 7.4 (p-valor = 0,216). Sin embargo a pH 4,5, se observan diferencias apreciables en la amplitud y cinética de la corriente de células no transfectadas y transfectadas con el vector sólo (56,1 ± 6,1 pA a +80 mV n = 4) con respecto a células transfectadas con el plásmido recombinante (107,9 ± 84,8 pA a +80 mV; n = 4); aunque las diferencias no son estadísticamente significativas (p-valor = 0,143). Estos resultados sugieren que LbClC-D se comportaría como un co-transportador H+/Cl- pH-dependiente, pero deben realizarse más estudios que permitan corroborarlo estadísticamente

Abstract. Leishmania are unicelular parasites, which cause the neglected human disease Leishmaniasis, a worldwide Public Health problem. During its life cycle this parasite adapts to environments with different ionic composition, pH, osmolarity and temperature, while securing adequate nutrient exchange and ion homeostasis. To achieved these, the parasite expresses a H+-ATPase coupled to an anion current to generate a H+ driving force use to concentrate glucose and amino acids while adjusting pH. The molecular nature of the anion current associated is poorly understood. After the injection of total mRNA from Leishmania amazonensis and Leishmania braziliensis in amphibian oocytes, our group has recorded chloride voltage currents that appear to be of parasite origin, opening the route to search for chloride anion channels in the Leishmania genome. In this study, the putative chloride channel of L. braziliensis LbClC-D (LbrM33_V2.1260) was cloned after RT-PCR into pGEM®-T Easy. The obtained sequence is 99.6% identical to that deposited at GeneDB. The gene was then ligated into the expression vector pmEGFP-1 and transfected into mammalian cells for electrophysiological recordings with patch clamp. A small percentage of the transfected cells expressed mEGFP that was verify by fluorescent microscopy, and presumably the protein of interest. The fluorescence observed was uniformly distributed in the cell. Non-voltage dependent outward currents of similar amplitude were recorded in control and transfected cells at pH 7.4 (p-value = 0,216). However, apreciable differences in both amplitude and kinetics of the current were recorder at pH 4.5 although it were non-estatistically significant (p-value = 0,143). These findings suggest that LbClC-D would behave like a H+/Cl- pH-dependent exchanger, but it is needed further studies to confim this statistically.