Construcción de un adenovector que exprese proteínas inmunogénicas del virus de la diarrea viral bovina (BVDV)

Abstract

El desarrollo de vacunas recombinantes para el control de BVDV se realiza con el fin de superar los inconvenientes de las vacunas convencionales. Para propósitos de inmunización, el adenovirus se ha empleado como vector para transportar en su genoma genes extraños (transgenes) en regiones que son eliminadas (E1 y E3) no esenciales para la replicación e infectividad viral. Estas vacunas recombinantes permiten trabajar con las proteínas más inmunogénicas del virus como la glicoproteína de la envoltura E2. Esta proteína contiene los epítopes que inducen la producción de anticuerpos neutralizantes posteriores a la infección y a la vacunación. En esta investigación se construyó un Adenovirus recombinante de primera generación el cual expresa la proteína inmunogénica E2 del VDVB, a partir de una cepa de referencia. Para esto, el gen viral E2 fue clonado en dos formas: completa y truncada. La forma completa está constituida por 1380pb y la truncada por 1080pb. Estas fueron amplificadas por RT-PCR y clonadas dentro del plásmido pAdenovatorCuoCU-IRES-GFP. Este es un vector de transferencia que constitutivamente expresa el promotor viral CMV. A los genes de la E2 se les adicionó sitios de restricción para la enzima BglII que facilitaron la inserción dentro del plásmido. Posteriormente, el pAdenovatorCuoE2 IRES-GFP se recombinó con el plásmido de expresión adenoviral pAdeasy-1. Este procedimiento se llevó a cabo en bacterias electrocompetentes que permiten la recombinación como las E.coli BJ5183. Una vez obtenido el plásmido adenoviral con el transgen (pAdeasy-1CMV5E2-IRES-GFP), se evaluó in Vitro el nivel de expresión de la construcción en células 293A transfectadas transitoriamente, mediante fluorescencia y western blot. Finalmente, se amplificó el virusm recombinante en las mismas células complementarias. En la investigación se logró la amplificación de la proteína a partir de la cepa de referencia, la inserción en el vector de transferencia bajo el control de un promotor y la obtención del adenovirus recombinante. Con esta construcción se espera ampliar el conocimiento en el desarrollo de estas vacunas y comenzar a generar biológicos con cepas nativas; así como también, empezar a implementar esta tecnología con otros virus de igual o mayor impacto en las explotaciones pecuarias colombianas. / Abstract. Novel approaches to BVDV vaccination like recombinant vaccines have been development to overcome the shortcomings of the conventional vaccines. In this context the adenoviruses have been employed like a gene transfer vector for immunization purposes. The principal sites of insertion of foreign genetic material into the adenovirus are the E1 and E3 regions. These are called of first generation. The main foreign genetic materials in the recombinant vaccines to BVDV are the immunogenic proteins like the envelope glycoprotein E2. It elicits the antibodies neutralizing after immunization and infection. In the research we constructed a recombinant adenovirus which expresses a portion of BVDV genome that encodes glycoprotein E2 from the NADL strain. This protein was cloned in two forms: E2 complete and E2 truncated lacking a part of membrane anchor in order to evaluate the expression on the vector. The clone E2 complete contains 1380pb and the E2 truncated contains 1080pb. They were amplified by reverse transcription PCR and then inserted into the pAdenovatorCuoCUIRES-GFP. This is a shuttle vector which constitutively express CMV promoter. All E2 genes contain BglII restriction sites at both site ends. The DNA of shuttle vector was also cleaved by the same enzyme to remove the Cu gen. The E2 and plasmid were ligated and the specificity of the cloning was determined by sequencing. Then we made the co-transformation of the PmeI linearized shuttle vector recombinant and pAdEasy-1 into E.coli BJ5183 in order to allowed homologous recombination. Once obtained the adenoviruses recombinant, this was employed to transfect a cell line permissive 293A. This is a cell line derived from human embryonic kidney cell which expressed E1 viral gene they are permissive for grow of Ad viruses that are defective in E1 functions. We made these transfections to obtained high levels of the adenovirus recombinant. The expression of E2 was determinate by the reporter gen GFP is this cell line and western blot as well. The expression of E2 from laboratory strain is a starting point for the development of a recombinant vaccine from native’s strains virus. We hope to employ these constructions to evaluate the immunogenicity. We also hope employ this technology in virus with more impact in our husbandry.