Importancia de la estabilidad cinética de complejos HLA clase II/péptido formados en presencia de HLA-DM en la inmuno-dominancia de un epítope universal candidata a vacuna contra la malaria

Abstract

Introducción: La proteína de circumsporozoito (CS) de Plasmodium falciparum (parásito causante de la mayor morbi-mortalidad por malaria en el mundo) posee un péptido de 20 aminoácidos (326EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT345) denominado T*. Por presentarse en múltiples haplotipos HLA-DR y estimular eficientemente a los linfocitos T CD4+ (LT-CD4+) para que produzcan interferón gama (IFN-), una citoquina importante en la respuesta inmune protectiva contra el parásito, T* ha sido evaluado con éxito como candidato a vacuna contra la malaria en varios estudios clínicos en humanos. T* posee dos epítopes: T*-1 ubicada en el extremo amino terminal que es altamente variable y QNT-6 una secuencia ubicada en el extremo carboxi-terminal altamente conservada en cepas de P. falcíparum aisladas de diferentes partes del mundo. Por ser altamente conservado QNT-6 es un importante candidato a vacuna contra la malaria, sin embargo, evidencias experimentales recientes en nuestro laboratorio sugieren, que la asociación de QNT-6 con moléculas HLA-DR genera complejos MHC clase II/péptido altamente inestables en presencia de HLA-DM, una molécula presente en las células que presentan el antígeno in vivo. Recientemente en la búsqueda de alternativas para mejorar la estabilidad de la secuencia QNT-6, hemos encontrado un análogo de QNT-6 altamente estable en presencia de HLA-DM (péptido QNT-Y), en el que se sustituyó en QNT-6 el aminoácido Leucina (L) en la posición 335 con el cual este péptido se ancla al bolsillo P-1 de la molécula HLA-DR4 por tirosina (Y). Objetivo: Comprobar la importancia de la estabilidad cinética de complejos HLA-DR4/péptido formados en presencia de HLA-DM en la inmunogenicidad para LT-CD4+. Metodología: Para analizar las diferencias en la inmunogenicidad para los LT-CD4+ de péptidos con diferente estabilidad cinética a HLA-DM (QNT-6 y QNT-Y), se realizaron ensayos in vitro utilizando células de donantes HLA-DR1*0401 (DR4) para la generación de líneas específicas contra T1BT* y tras su estimulación con DCs pulsadas con péptido se determinó mediante citometría de flujo la expresión de CD27 y CD69, la capacidad de producción de citoquinas mediante CBA, los niveles de proliferación de LT-CD4+ y el porcentaje de células tetrámero positivas para QNT-6, QNT-Y y T*-1. Adicionalmente se realizaron ensayos in vivo utilizando ratones transgénicos DR4, los cuales fueron inmunizados con T1BT* o T1BT*-Y para determinar la capacidad de producción de anticuerpos mediante ELISA y la capacidad de producción de IFN- mediante ELISPOT. Resultados: Mediante ensayos in vitro e in vivo se obtuvieron evidencias que sugieren que el péptido QNT-Y es menos inmunogénico que el péptido QNT-6. Estas evidencias se basan en experimentos in vitro que mostraron que las líneas celulares generadas con el péptido T1BT*-Y generaban un menor número de células de memoria y efectoras, al igual que una baja diferenciación medida por la expresión de CD27, menor capacidad de producción de IFN- y menor porcentaje de células tetrámero positivas para los diferentes péptidos, cuando se comparan con las líneas generadas con el péptido T1BT*. De igual forma mediante ensayos in vivo utilizando ratones transgénicos se encontró que los ratones vacunados con el péptido T1BT* generaron un mayor título de anticuerpos contra NANP al igual que los esplenocitos de estos ratones fueron capaces de producir IFN- tras su re-estimulación in vitro con los péptidos QNT-6 y QNT-Y. Conclusiones: Los resultados sugieren que el cambio de la leucina en la posición 335 por tirosina, generó un péptido QNT-Y que tiene una alta estabilidad y que probablemente genera interacciones de alta afinidad TCR-pMHC lo cual probablemente hace que se supere el nivel intermedio de afinidad que parece ser el óptimo para la estimulación de los linfocitos T específicos. / Abstract. Introduction: The circumsporozoite protein (CS) of Plasmodium falciparum (the parasite that causes increased morbidity and mortality from malaria in the world) has a 20 amino acid peptide (326EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT345) called T *. As presented in multiple haplotypes HLA-DR and stimulate efficiently to CD4 + T cells (LT-CD4 +) to produce interferon gamma (IFN-), an important cytokine in the protective immune response against the parasite, T * has been evaluated success as a candidate malaria vaccine in human clinical studies. T * has two epitopes: T * -1 located at the amino terminus that is highly variable and QNT-6 sequence located at the carboxy-terminal highly conserved among strains of P. falciparum isolated from different parts of the world. Being highly conserved QNT-6 is a major candidate malaria vaccine, however, recent experimental evidence in our laboratory suggest that the QNT-6 association with HLA-DR class II MHC complex generates peptide highly unstable presence of HLA-DM, a molecule present in the antigen presenting cells in vivo. Recently in the search for ways to improve the stability of the QNT-6 sequence, we found a QNT-6 analog highly stable in the presence of HLA-DM (QNT-Y peptide), which was replaced in the QNT-6 Leucine (L) at position 335 with which the peptide is anchored to the pocket P-1 of the HLA-DR4 by tyrosine (Y). Purpose: To determine the importance of kinetic stability HLA-DR4/peptide complexes formed in the presence of HLA-DM in immunogenicity for LT-CD4+. Methods: To analyze the differences in immunogenicity for the LT-CD4 + peptides with different kinetic stability of HLA-DM (QNT-6 and QNT-Y), tests were conducted in vitro using donor cells HLA-DR 1*0401 (DR4) for the generation of specific T cell anti T1BT* and after stimulation with peptide-pulsed DCs was determined by flow cytometry the expression of CD27 and CD69, the ability of cytokine production by CBA, proliferation levels of LT- CD4 + cells and the percentage of tetramer-positive QNT-6, QNT-Y and T * -1. Additionally vivo tests were performed using DR4 transgenic mice, which were immunized with T1BT* or T1BT*-Y to determine the ability of antibody production by ELISA and the production capacity of IFN- by ELISPOT. Results: Using in vitro and in vivo test were obtained evidence to suggest that the peptide QNT-Y is less immunogenic than QNT-6 peptide. These evidences are based on in vitro experiments that showed that the cell lines generated with peptide T1BT*-Y generated fewer effector memory cells, as measured by a low differentiation of CD27 expression, decreased production IFN- and lower percentage of tetramer positive cells for different peptides when compared with the lines generated with peptide T1BT*. Similarly by tests in vivo using transgenic mice was found that mice immunized with the peptide T1BT * generated a higher antibody titer against NANP as splenocytes of these mice were able to produce IFN- after re-stimulation in vitro with peptides QNT-6 and QNT-Y. Conclusions: The results suggest that the change of the Leucine at position 335 by tyrosine, generated a peptide QNT-Y which has a high stability and probably generates high affinity interactions TCR-pMHC which probably exceeded the intermediate level affinity which appears to be optimal for stimulation of specific T lymphocytes.