Desarrollo de una metodología de PCR en Tiempo Real para detección y cuantificación de fitoplasma 16SrIII-L y reovirus CFSV asociados con la enfermedad del Cuero de Sapo en yuca

Abstract

El presente trabajo tuvo como objetivo diseñar una metodología de qPCR que permita certificar semilla de yuca a la enfermedad del cuero de sapo, conocer la distribución de cada uno de los agentes asociados a la enfermedad del cuero de sapo y hacer una aproximación al rol de cada uno en el proceso de la enfermedad del cuero de sapo. Se diseñaron sondas TaqMan® y cebadores, a partir del gen rp para la detección del fitoplasma 16SrIII-L) y RNA 4 para el reovirus CFSV. Para evaluar la distribución de los microorganismos en la planta se fraccionaron plantas de los genotipos BIPD 284-35, 289-42, 284-43, 249-45, 284B-66, y secundina en tres partes: tercio inferior, medio y superior. Una vez realizadas las detecciones (fitoplasma, virus, fitoplasma-virus y Ct superiores de 35) estas plantas se llevaron a campo. La técnica de qPCR desarrollada presentó una sensibilidad en la detección de 100 y 1000 veces en comparación con RT-PCR y PCR anidado respectivamente; mostrando para la detección de fitoplasma una excelente correlación entre la presencia de síntomas en raíces enfermas y el porcentaje de detección (92.5%), mientras que el virus presentó un porcentaje de 76.47%. La distribución de los dos organismos asociados es de forma irregular en los diferentes tercios de la planta. El comportamiento de las variables de peso en el aire, número de raíces enfermas y porcentaje de severidad al momento de la cosecha, sugiere que la coinfección de virus y fitoplasma en las raíces genera un fenómeno de hipovirulencia dilucidando de esta manera el posible rol de los dos patógenos.

//Abstract: This study aimed to design a qPCR methodology for certifying seed cassava, knowing the distribution of each of the two pathogens associated with disease and to make an approach to the role of each in the disease process. TaqMan® probes and primers were designed from rp gene for the detection of phytoplasma 16SrIII-L) and RNA 4 for the reovirus CFSV. For the distribution of the agents associated were fractionated plants genotypes BIPD 284-35, 289-42, 284-43, 249-45, 284B-66, and secundina in the lower third, middle and higher, depending on the detections (phytoplasma, viruses, phytoplasma-virus and higher Ct 35) these plants were sown in the field. qPCR technique developed has a sensitivity 100 to 1000 times higher compared with RT-PCR and nested PCR, respectively, showing for the detection of phytoplasma an excellent correlation with the presence of symptoms in diseased roots and detection rate (92.5% ) that the grafting technique, while the virus presented a percentage of 76.47%. The distribution of the two pathogens is irregular in the different parts of the plant. The behavior of the variables of weight in air, root number and percentage of severely at the time of harvest, suggesting that mix infection of viruses and phytoplasma on roots generates a phenomenon of hypovirulence thus elucidating the possible role of two pathogens.