Aislamiento y caracterización de una polifenoloxidasa relacionada con la tolerancia del clavel (dianthus caryophyllus) a fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2

Abstract

Se purificó y caracterizó bioquímicamente la enzima polifenoloxidasa (PFO) inducida en tallos de clavel (Dianthus caryophyllus L) de variedad tolerante por inoculación conel patógeno Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2 (FOD2), causante del marchitamiento vascular. La purificación se logró a través de procesos sucesivos de cromatografía en columna de intercambio iónico, de interacción hidrofóbica y de exclusiónmolecular. A través de éstos se logró un factor de purificación de 314 veces con respecto al extracto inicial. La proteína purificada mostró actividad PFO y una única banda en SDS-PAGE correspondiente a 40 kDa. Usando catecol como sustrato, se determinó su temperatura óptima en 45 ºC y su pH óptimo en 7,5. La enzima presentó una cinética tipo Michaelis-Menten con un valor Km de 249 mM y Vmáx 322 U/min. El punto isoeléctrico (PI= 5,0) permitió establecer que se trata de una proteína de tipo ácido. Con la enzima purificada se realizaron ensayos in vitro de actividad fungitóxica, usando sus productos de reacción enfrentados al hongo FOD2, encontrándose una actividad inhibitoria importante de cerca del 57% a las 24 horas, lo que permite postular su papel en los mecanismos de defensa del clavel contra este patógeno vascular.

Polyphenoloxidase (PPO) was isolated and purified from stems of carnation (Dianthus caryophyllus L) after the inoculation with Fusarium oxysporum f. sp. dianthi race 2 (FOD2) of a tolerant variety. Purification was performed using column chromatography of ionic exchange, hydrophobic interaction and molecular exclusion. With these successive steps, a factor of 314 fold purification was achieved. The SDS-PAGE analysisshowed one band of 40 kDa. The purified enzyme was partially characterized using cathecol as substrate and determined the optimal temperature as 45ºC and 7.5 as optimal pH. The enzyme showed a Michaelis-Menten kinetic with Km of 249 mM and Vmax 322 U/min. The IP was 5.0 indicating the acidic character of this protein. Using the purified enzyme and its reaction products, in vitro fungitoxic assays were realizedindicating an important inhibitory activity against FOD2 of 57% at 24 hours. Then, it is possible to postulate that this enzyme is activated as a part of the defense mechanismsin this interaction model.