Potencial de autorrenovación y quiescencia de las células stem hematopoyéticas derivadas de sangre de cordón umbilical sometidas in vitro a un microambiente de nicho leucémico

Abstract

Las células stem mesenquimales (MSC) y las leucémicas interactúan en el microambiente leucémico y afectan diferencialmente a las demás células del nicho. Esta interacción, tiene implicaciones importantes sobre la biología y la función de las células stem hematopoyéticas (HSC). Para estudiar este aspecto, se estableció un modelo in vitro de nicho leucémico (NL), realizando un co-cultivo de MSC normales con medio condicionado de células REH, una línea celular de leucemia linfoblástica aguda pre-B. En este NL, las HSC (células CD34+) que normalmente están en un estado quiescente, entran en ciclo celular y proliferan; por el contrario, solo una pequeña fracción de células entran en ciclo celular en el nicho normal bajo condiciones idénticas. Esta pérdida de la quiescencia se acompañó del incremento en la expresión de Ki-67 y de c-Myc, dos marcadores asociados a la proliferación celular. Además, dos reguladores centrales de la quiescencia GATA2 y p53 disminuyeron su expresión. Interesantemente, la expresión de dos genes involucrados en la autorrenovación de las células CD34+, Klf4 y EZH2, se vio afectada de manera importante. En cambio, la expresión de c-Kit, aumentó en las células CD34+ del NL cuando se comparó con el nicho normal; sin embargo, su expresión fue menor al compararlo con las células CD34+ frescas. Estos resultados muestran claramente que la quiescencia y la autorrenovación se afectan considerablemente en este NL, además, también se muestra que en el NL las MSC mostraron una morfología aplanada, con la aparición de pequeñas vacuolas citoplasmáticas, detención del crecimiento y fueron positivas para la actividad de b-galactosidasa asociada a la senescencia. La evaluación del medio condicionado leucémico mostró un incremento en las citoquinas proinflamatorias IL-6 e IL-8, posibles efectores de los cambios observados en las células CD34+. Este NL in vitro, establecido sin células leucémicas, facilitará la evaluación de la expresión génica de las células CD34+ y el desarrollo de agentes terapéuticos que puedan neutralizar los factores solubles presentes y las vías de señalización celular involucradas en el funcionamiento defectuoso de las células CD34+.

Abstract. Mesenchymal stem cells (MSC) and leukemic cells interact in the leukemic niche [1] in the bone marrow and differentially affect each other and other cells in the LN. These interactions have striking implications for the biology and function of hematopoietic stem cells (HSC). To study these relationships, an in vitro model of the LN was established by co-culturing normal MSC with REH-conditioned medium, a pre-B acute lymphoblastic leukemia cell line. When quiescent HSC (CD34+ cells) are cultured in this LN, they enter the cell cycle and proliferate. In contrast, only a small fraction of the CD34+ cells enter the cell cycle in a normal niche, under identical conditions. This loss of quiescence was accompanied by increased expression of Ki-67 and c-Myc, two proliferation-associated markers. Furthermore, two central regulators of quiescence, GATA2 and p53, decreased their expression. Interestingly, the expression of two genes involved in CD34+ self-renewal, Klf4 and the EZH2 enzyme, was significantly affected. In contrast, expression of c-Kit, the Stem Cell Factor (SCF) receptor, increased in the LN CD34+ cells when compared to the normal niche; however, its expression was lower when compared to freshly isolated CD34+ cells. These results clearly show that quiescence and self-renewal are significantly affected in this LN. Besides, it was also revealed that MSC in the LN exhibited a flattened morphology, with the appearance of small cytoplasmic vacuoles, stopped growing and were positive for the enzymatic activity of beta-galactosidase, which is known to be associated with cellular senescence. The evaluation of the leukemic-conditioned medium showed an increase in the pro-inflammatory cytokines IL-6 and IL-8, possible effectors of the changes observed in CD34+ cells. This in vitro LN, established without leukemic cells, will facilitate the evaluation of CD34+ cell gene expression and the development of therapeutic agents that could neutralize the soluble factors present in this niche and the cellular signaling pathways involved in the flawed functioning of CD34+ cells.