Identificación y caracterización de especies de Colletotrichum spp., causantes de antracnosis en frutos de aguacate Persea americana var. Hass.

Abstract

La principal limitante de la producción de aguacate Persea americana Mill var. Hass en Colombia es la antracnosis causada por Colletotrichum spp., sin embargo, se desconoce su variabilidad inter e intraespecífica. Nuestro objetivo consistió en caracterizar morfológica y molecularmente los diferentes aislamientos de Colletotrichum spp., obtenidos de frutos de aguacate var. Hass en 14 municipios del Valle del Cauca. Además de evaluar la patogenicidad y control in vitro de cada uno de los aislamientos encontrados Se aislaron 59 cepas monoconidiales de las cuales se evaluó la velocidad de crecimiento radial, se realizó un análisis detallado del tipo, longitud y área de las conidias de cada uno los aislamientos, con el programa Image J. Además, se evaluaron variables morfológicas como la formación y distribución de las estructuras de resistencia y el color de los aislamientos. Se realizó un DCA con 59 tratamientos y 50 repeticiones, se analizó con el programa estadístico (SAS Deployment Wizard 9.4). Algunos aislamientos, formaron estructuras de resistencia como acérvulos y peritecios, después de los diez días de incubación. Se observó que si hay diferencia significativa para la velocidad de crecimiento radial en los aislamientos. El promedio de crecimiento radial total fue 35,4 mm/10 días., el R2 indicó que el experimento se ajusta un 72%. Se encontraron formas de las conidias oblongas en un 44%, fusiforme en un 35% arriñonada 19% y elíptica 2%. Se observó que si hay diferencia significativa para la variable área de conidias. El promedio total fue 73,49 µm2 de largo. Los resultados muestran una alta diversidad entre aislamientos provenientes de los diferentes sitios de producción y se presentan al menos tres especies de Colletotrichum spp. Debido a la importancia de la enfermedad en aguacate var. Hass, causada por el hongo Colletotrichum spp., se realizaron los análisis moleculares de los 59 aislamientos monospóricos obtenidos, donde se realizó la extracción de ADN y amplificación mediante PCR, utilizando los primers ITS1 e ITS4 para identificación de la secuencia ribosomal interna, y para secuencias parciales con los primers actina (ACT), Chitin syintetase 1 (CHS), Glyceraldehyde-3-fosphate dehydrogenase (GAPDH), β- tubulin 2 (TUB) Calmodulin (CAL), CgInt, y CaInt2. Los resultados muestran que el 45,8% amplifican positivo para Colletotrichum gloeosporioides y el 23,7% para Colletotrichum acutatum con un peso molecular aproximado de 490bp y 500bp respectivamente. Para las demás secuencias de genes se observa que 28 aislamientos amplifican para ACT, 54 para CHS, 52 para GD, 25 para TUB y 11 para CAL, estos resultados indican la amplia diversidad registrada de especies y razas del patógeno en el Valle del Cauca, la cual se determinó mediante secuenciación de ADN para algunos aislamientos. Para la exportación de aguacate var. Hass en Colombia se deben cumplir requisitos de orden fitosanitario, por lo que se evaluó la patogenicidad y la efectividad in vitro de fungicidas de síntesis química para 59 aislamientos monoconidiales de Colletotrichum spp., asociados a antracnosis en frutos de aguacate var. Hass. Para las pruebas de patogenicidad se utilizaron frutos con madurez fisiológica, los cuales se inocularon con aislamientos de 8 dds, a una concentración de 106 conidias/ml y se utilizó un diseño completamente al azar (DCA). Para las pruebas de susceptibilidad/resistencia al control químico, se evaluaron 6 fungicidas: Tebuconazole + Prochloraz; Azoxystrobin + Tebuconazole; Prochloraz; Sulfato de cobre pentahidratado; Myclobutanil; y Azoxystrobin + Flutriafol y un testigo; determinando de manera visual los cambios microscópicos de las estructuras somáticas y reproductivas. Seis aislamientos de los 59 se destacaron por su alta patogenicidad y 8 con resistencia a fungicidas. Hubo diferencias significativas en la efectividad media de los fungicidas: Prochloraz 99.7%; y Tebuconazole + Prochloraz 99.2%; Azoxystrobin + Tebuconazole 85.5%; Azoxystrobin + Flutriafol 56.5%; Myclobutanil 18.3% y Sulfato de Cobre Pentahidratado 9.8%. Los efectos estructurales de los fungicidas en los aislamientos escogidos al azar, consistieron en deformaciones acompañadas de engrosamiento del micelio. Se discute las implicaciones de los resultados en el manejo de la enfermedad.

//Abstract: The main limitation of the production of avocado Persea americana Mill var. Hass in Colombia is the anthracnose caused by Colletotrichum spp., However, its inter- and intraspecific variability is unknown. Our objective was to characterize morphologically and molecularly the different isolates of Colletotrichum spp., obtained from fruits avocado var. Hass in 14 municipalities of Valle del Cauca. In addition to evaluating the pathogenicity and in vitro control of each of the isolates found, 59 monoconidial strains of which the radial growth rate was evaluated, a detailed analysis of the type, length and area of the conidia of each one Isolates, with Image J. In addition, we evaluated morphological variables such as the formation and distribution of resistance structures and the color of the isolates. We performed a DCA with 59 treatments and 50 replicates, which was analyzed using the statistical software (SAS Deployment Wizard 9.4). Some isolates, formed structures of resistance like acérvulos and perithecios, after the ten days of incubation. It was observed that if there is significant difference for the radial growth rate in the isolates. The average total radial growth was 35.4 mm / 10 days, the R2 indicated that the experiment adjusted 72%. Forms of oblong conidia were found in 44%, fusiform in 35% hailed 19% and elliptical 2%. It was observed that if there is significant difference for the conidia area variable. The total average was 73.49 μm2 in length. The results show a high diversity between isolates from different production sites and at least three species of Colletotrichum spp. Due to the importance of the disease in avocado var. Hass, caused by the fungus Colletotrichum spp., The molecular analyzes of the 59 monosporic isolates obtained were performed, where DNA extraction and PCR amplification were performed using the ITS1 and ITS4 primers to identify the internal ribosomal sequence and (ACT), Chitin syintetase 1 (CHS), Glyceraldehyde-3-fosphate dehydrogenase (GAPDH), β-tubulin 2 (TUB) Calmodulin (CAL), CgInt, and CaInt2. The results show that 45.8% amplify positive for Colletotrichum gloeosporioides and 23.7% for Colletotrichum acutatum with an approximate molecular weight of 490bp and 500bp respectively. For the other gene sequences it is observed that 28 isolates amplify for ACT, 54 for CHS, 52 for GD, 25 for TUB and 11 for CAL, these results indicate the wide diversity of species and races of the pathogen in Valle del Cauca, which was determined by DNA sequencing. For some isolates. For the export of avocado var. Hass in Colombia, phytosanitary requirements must be met, and the pathogenicity and in vitro effectiveness of chemical synthesis fungicides were evaluated for 59 monoconidial isolates of Colletotrichum spp., Associated with anthracnose in avocado var Hass fruits. For the pathogenicity tests, fruits with physiological maturity were used, which were inoculated with isolates of 8 dds, at a concentration of 106 conidia / ml and a completely randomized design (DCA) was used. For the susceptibility / resistance tests to chemical control, 6 fungicides were evaluated: Tebuconazole + Prochloraz; Azoxystrobin + Tebuconazole; Prochloraz; Copper sulphate pentahydrate; Myclobutanil; And Azoxystrobin + Flutriafol and a control; Visually determining microscopic changes in somatic and reproductive structures. Six isolates of the 59 were distinguished by their high pathogenicity and 8 with resistance to fungicides. There were significant differences in the average effectiveness of the fungicides: Prochloraz 99.7%; And Tebuconazole + Prochloraz 99.2%; Azoxystrobin + Tebuconazole 85.5%; Azoxystrobin + Flutriafol 56.5%; Myclobutanil 18.3% and Copper Sulphate Pentahydrate 9.8%. The structural effects of fungicides on randomly selected isolates consisted of deformations accompanied by thickening of the mycelium. The implications of the results in the management of the disease are discussed.