Estudio de la nicotinamida/nicotinato mononucleótido adenililtransferasa de giardia lamblia (gnmnat): determinación de la localización subcelular y aproximación estructural

Abstract

Giardia lamblia es un organismo divergente, causante de una enfermedad denominada Giardiasis. Este parásito reviste especial interés biológico por su posición evolutiva basal y metabolismo simplificado; por esta razón es importante estudiar el metabolismo del NAD+ en este organismo y así conocer sus diferencias con otros modelos de estudio. El Dinucleótido de Adenina y Nicotinamida (NAD+) es una molécula de relevancia metabólica y celular que actúa como cofactor, sustrato y participa en procesos de transducción de señales intracelulares. Las distintas rutas de síntesis de este metabolito convergen en la enzima Nicotinamida/Nicotinato Mononucleotido Adenililtransferasa (NMNAT) (EC: 2.7.7.1/18). En estudios previos se identificaron por herramientas bioinformáticas dos candidatos para la NMNAT de G. lamblia (GlNMNAT-A y GlNMNAT-B); los cuales se clonaron, expresaron y evaluaron enzimáticamente. En el presente trabajo se continuó el estudio de la GlNMNAT-A, mediante aproximaciones bioinformáticas y experimentales. Específicamente, se generó un modelo estructural in sillico y se evaluó la expresión de esta proteína, mediante retro-transcripción. Adicionalmente, se realizaron estudios de inmunodetección; para lo cual se produjeron anticuerpos policlonales en modelos murinos y aviares (IgG e IgY). De igual manera, se estudió la localización intracelular de la GlNMNAT-A, mediante el empleo de transgenes. El modelo bioinformático generado presentó características representativas de las NMNAT, fundamentales para la función biosintética de estas enzimas. El análisis transcripcional mostró una baja expresión de las isoenzimas en trofozoitos de G lamblia. Finalmente, los análisis de localización mostraron patrones de ubicación citoplasmática de la GlNMNAT-A en trofozoítos y quistes del parásito.

Abstract: Giardia lamblia is a divergent organism and is the causal agent of a disease called giardiasis. This parasite has a special biological interest regarding its evolutive position and its simplified metabolism. For the above is important to study the NAD+ metabolism this organism in order to determine differences with other parasites. The Nicotinamide Adenine Dinucleotide (NAD+) is a fundamental molecule in the cellular metabolism. NAD+ act as a cofactor, substrate and participate in processes like signal transduction. The NAD+ Synthesis routes converge in the enzyme Nicotinamide /Nicotinate Mononucleotide Adenylyltransferase (NMNAT) (EC:2.7.7.1/18). Previous studies identified two candidate sequences for NMNAT (glNMNAT-A y glNMNAT-B) of G. lamblia by bioinformatic tools. These candidates were cloned, expressed, and their enzymatic activity was evaluated. In this work the study of glNMNATs is continued by means of bioinformatic and experimental approaches. Specifically a structural model was generated in silico. Protein transcription was determined using retrotranscription. Additionally, polyclonal murine and avian antibodies (IgG and IgY) were produced in order to detect the expression of the glNMNATs. In the same way, glNMNATs cellular location was evaluated using transgenes. The bioinformatic model showed NMNATs representative features. These features are important to biosynthetic function. Transcriptional analysis showed a cytoplasmic location of glNMNAT in trofozoítos and in the parasite cyst.