Contribución a la implementación de un ensayo de permeación bucal in vitro, empleando cafeína como compuesto modelo

Abstract

Los estudios de permeación bucal in vitro empleando mucosa porcina se consideran útiles en el desarrollo temprano de formulaciones; sin embargo, a nivel mundial se ha reportado una falta de reproducibilidad al emplear tejidos animales atribuida a la ''variabilidad biológica'', por lo que, al implementar este tipo de ensayos en el Grupo de Investigación, se pretendió ahondar en las diferentes variables que pudieran tener influencia, empleando cafeína como compuesto modelo de moléculas hidrofílicas. Se validó una metodología analítica por cromatografía líquida de alta eficiencia con detector de arreglo de diodos (HPLC-DAD) para la cuantificación de la cafeína, utilizando una columna de fase reversa C18 con detección UV a 273 nm y una fase móvil constituida exclusivamente por agua-acetonitrilo (80:20 v/v). Las características de desempeño evaluadas permitieron comprobar que existe una adecuada selectividad, una linealidad entre 0.5 y 50 ug/mL, con una precisión expresada como RSD menor a un 2%, un porcentaje de recuperación del 99.9% y unos límites de detección y cuantificación para el método de 0.85 y 2.69 ng/mL, respectivamente; así mismo, se evaluó la estabilidad sometiendo alícuotas tanto de la validación del sistema como del método a diferentes condiciones de tiempo y temperatura de almacenamiento, sin presentar una degradación significativa. Por medio del análisis de muestras histológicas de la mucosa bucal, la evaluación de esta membrana por el método de pérdida de agua transmucosa y los ensayos de permeación empleando celdas de Franz, se estudió el efecto de la técnica de separación, los medios, la temperatura y el tiempo de almacenamiento sobre la morfología celular y la organización del tejido, la integridad de la membrana y parámetros asociados a la permeación (flujo en estado estacionario, constante de permeabilidad y cantidad acumulada a las 4 horas). Se determinó que se pueden realizar cortes con bisturí o dermatomo sin alterar los parámetros de permeabilidad, mientras que la separación por calor presenta un comportamiento diferente. El almacenamiento de los tejidos en una solución de Krebs-Ringer-Bicarbonato a 4 °C, mantuvo el tejido en óptimas condiciones por 24 horas, mientras los procesos de congelación evidencian cambios a nivel de las células epiteliales superiores, pero en menor proporción cuando se usan criopreservantes con dimetilsulfóxido y suero fetal bovino. La medida de la integridad de la membrana, mediante la técnica de pérdida de agua transmucosa, demostró ser un buen indicador de este parámetro, siendo una alternativa rápida y poco explorada con mucosa bucal que permite seleccionar los tejidos para los ensayos de permeabilidad de manera práctica, pero que idealmente podría ser complementada con otras técnicas. En conclusión, mediante la realización de este trabajo de investigación se establecieron las condiciones de las variables para la implementación del ensayo de permeación bucal in vitro, para compuestos hidrofílicos, empleando cafeína como molécula modelo.

Abstract: In vitro oral permeation studies using porcine mucosa are considered useful in the early development of formulations; however, a lack of reproducibility has been reported worldwide in the use of animal tissues attributed to "biological variability", so, when implementing this type of tests in the Research Group, we intend to delve into the different variables that may have influence, using caffeine as a model compound of hydrophilic molecules. An analytical methodology was validated by high performance liquid chromatography with a diode array detector (HPLC-DAD) for the quantification of caffeine, using a C18 reverse phase column with UV detection at 273 nm and a mobile phase consisting exclusively of water- Acetonitrile (80:20 v/v). The evaluated performance characteristics allowed to verify that there is an adequate selectivity, a linearity between 0.5 and 50 μg/mL, with a precision expressed with a RSD of less than 2%, a recovery rate of 99.9%, and both detection and quantification limits for the method at 0.85 and 2.69 ng/mL, respectively; likewise, the stability was evaluated by subjecting aliquots of both the system and the method validation to different conditions of storage time and temperature, without exhibiting significant degradation. Through the analysis of histological samples of the buccal mucosa, the evaluation of this membrane by the transmucosal water loss method and the permeation tests using Franz cells, it was studied the effect of the separation technique, media, temperature and storage time on cell morphology and tissue organization, membrane integrity and parameters associated with permeation (flow, permeability constant and the amount permeated at 4 hours). It was determined that cuts with a scalpel or dermatome can be performed without altering the permeability parameters, while the separation by heating presents a different behavior. The storage of the tissues in a Krebs-Ringer-Bicarbonate solution at 4 ° C, kept the tissue in optimal conditions for 24 hours, while the freezing processes evidenced changes at the level of the superior epithelial cells, but to a lesser extent when using cryopreservants with dimethylsulfoxide and fetal bovine serum. The measurement of membrane integrity, using the transmucosal water loss technique, proved to be a good indicator of this parameter, being a fast and yet a poorly explored alternative with buccal mucosa that allows to select the tissues for the permeability tests in a practical way, but ideally it could be complemented with other techniques. In conclusion, through the realization of this research work, we established the conditions of the variables for the implementation of the oral permeation test in vitro, for hydrophilic compounds, using caffeine as model molecule.