Evaluación de cambios en la actividad Osteoclástica con la aplicación de agentes reductores u oxidantes en células U937 fusionadas con polietilenglicol

Abstract

A partir de la teoría de que la fusión celular es esencial para la función del Osteoclasto y su rol en el mantenimiento del control de la masa ósea y osteoclástica, se desarrolló un modelo para la obtención de células similares a osteoclastos que son capaces de realizar resorción utilizando polietilenglicol (PEG). Se demostró que su aplicación en monocitos (línea celular U937) genera fusión, y que este evento es suficiente para la expresión de genes específicos del Osteoclasto, y resorción ósea. El propósito de este trabajo fue investigar los cambios en la actividad resortiva al aplicar distintos agentes oxidantes y reductores sobre este modelo. Método: Se indujo fusión de células U937, para obtener células similares a osteoclastos, con 0.5μl PEG mw:1450 por cada 50.000 células que fueron sembradas sobre láminas de hueso, o un grupo control no tratado con PEG; las células fueron resuspendidas en DMEM con SFB al 10%, y mantenidas bajo una atmosfera humidificada al 5% de CO2 a 37°C durante 2 horas; aplicándolos directamente en el medio y en diferentes tiempos, se realizó inducción oxidativa con DMNQ 0.15μM, homocisteína 100μM, peróxido de hidrógeno 50μM o tratamiento con agentes reductores TROLOX 500μM, TEMPOL100μM, ácido ascórbico 50μg/ml, NAC 30mM, GSH 32mM + BME 25μM . Se evaluó presencia de especies reactivas de oxígeno (ROS), tinción para TRAP (fosfatasa ácida tartrato resistente), actividad resortiva y expresión de marcadores osteoclásticos. Resultados: La fusión con PEG induce la generación de ROS, el aumento en el porcentaje de células TRAP +, la formación de anillos de actina y el área resorbida con respecto a las células no fusionadas. El tratamiento con agentes oxidantes en los días 0 y 1 después de fusionar con PEG genera un aumento en ROS consecuente con un aumento de TRAP, anillos de actina y resorción ósea, de manera contraria se produjo una disminución de estos con el tratamiento con agentes reductores en estas etapas; el pretratamiento con agentes oxidantes y reductores generó una disminución en la resorción para ambos casos, sin embargo, la aplicación de ambos tipos de tratamiento en los días 2 y 3 después de la fusión con PEG no generó cambios significativos en la resorción. Conclusión: La fusión per se implica la generación de ROS, aumentando la expresión de marcadores osteoclastogénicos y actividad resortiva, dichas características se acentúan al aplicar reactivos oxidantes, sugiriendo que el estado oxido reductor de la célula es crítico para la supervivencia, estabilidad de la fusión y para el inicio de la actividad osteoclastogénica Palabras

Abstract: Based on the theory regarding nuclear fusion is essen tial for the osteoclast function and its role in maintaining control of both the bone mass and osteoclastic resorption, a model was developed in order to obtain osteoclasts like cells that are able to bone resorption using p olyethylene glycol (PEG). It was demonstrated that its application in monocytes (cell line U 937) generates fusion, and this event is enough for the expression of osteoclast specific genes, and bone resorption. The purpose behind this work was to investigate the changes in the resorptive activity when applying different oxidant and reducing agents using this model. Method: Fu sion of U937 cells were induced to obtain osteoclast like cells with 0.5 μ l PEG mw:1450 per 50.000 cells that were seeded in bone slices, or a control group that were not treated with PEG; cells were resuspended in DMEM with SFB at 10%, and kept under a humidified atmosphere with 5% of CO 2 at 37°C during 2 hours; Applying direc tly in the culture media and at different times ; oxidant induction was achieved with DMNQ 0.15 μ M, Homocysteine 100 μ M, Hydrogen peroxide 50 μ M , besides treatment with reducer agents TROLOX 500 Μ m, TEMPOL 100 Μ m, Ascorbic Acid 50 μ g/ml, NAC 30Mm, GSH 32Mm + BME 25 Μ m. The presence of reactive species of oxygen (ROS) was evaluated, osteoclast differentiation was determined by Tartrate - resistant acid phosphatase (TRAP) staining, resorptive activity and expression of osteoclastic markers. Results: PEG fusion r esults in ROS generation, increase in the TRAP + cells percentage, actin ring formation and resorbed area compared with non - treated cells. Treatment with oxidants on days 0 and 1 after PEG fusion results in increased levels of ROS, TRAP+ cells percentage, actin rings and bone resorption, treatment with reducers had an opposite effect decreasing these aspects; pretreatment with oxidants and reducers showed a decrease in bone resorption in both cases; otherwise oxidant and reducers applied on days 2 and 3 aft er PEG fusion did not show significative changes in bone resorption. Conclusion: Fusion itself implies ROS generation in turn increasing the expression of osteoclastogenic markers and resorptive activity, these characteristics are accentuated when applyin g oxidizing reagents, suggesting that the redox state of the cell is critical for survival, fusion stability and the beginning of the osteoclastogenic activity .