Evaluación in vitro e in silico de una libreria de diterpenos de origen marino

Abstract

El cáncer es un grupo de enfermedades caracterizado por un crecimiento descontrolado de células anormales y la colonización otros tejidos, que puede resultar en la muerte del paciente. Estas enfermedades tienen una alta prevalencia, incidencia y mortalidad a nivel mundial. Actualmente, existe un gran arsenal terapéutico para el tratamiento de estas enfermedades, sin embargo existe una necesidad constante de buscar compuestos nuevos y con mayor efectividad en la terapéutica de esta patología.

Dentro de los compuestos de origen natural, que se han caracterizado por ser buenos agentes citotóxicos, los diterpenos han mostrado ser uno de los metabolitos especializados con mayor potencial para el tratamiento del cáncer. Los organismos marinos, como los octocorales y las algas, son una fuente prolífica de diterpenos, convirtiéndolos en una fuente rica de agentes antitumorales.

Como parte de los estudios llevados a cabo al interior del grupo de investigación Estudio y aprovechamiento de productos naturales marinos y frutas de Colombia, sobre los diterpenos aislados de octocorales, en este trabajo se evaluó la actividad citotóxica de una librería compuesta por 32 miembros, de origen tanto natural como semisintético, frente a tres líneas celulares de cáncer humano, A549 (cáncer de pulmón), MCF7 (adenocarcinoma de mama) y PC3 (cáncer de próstata) a través del ensayo de viabilidad celular MTT. Así, se seleccionaron tres diterpenos con actividad citotóxica frente a las tres líneas celulares, los compuestos 1, 17 y 26, quienes presentaron valores de concentración inhibitoria 50 (IC50) menores a 30 µM.

Para determinar si los compuestos activos son inductores de la apoptosis o de necrosis, se evaluó el tipo de efecto citotóxico a través del uso de ensayos de citometría de flujo empleando los fluorocromos Anexina V y 7AAD. Se evaluaron las concentraciones IC25, IC50 y IC75 de cada uno de los compuestos frente a línea celular A549. A través del análisis de la población celular positiva para cada uno de los fluorocromos se determinó que los tres compuestos fueron inductores de la apoptosis en esta línea celular.

Posteriormente, para determinar si la inducción de la apoptosis observada es a través de un efecto antimitótico, se evaluó la interacción de los tres ligandos con la tubulina por RMN. Esto fue llevado a cabo, a través del experimento STD, donde fue posible determinar los epítopos de unión de cada uno de los ligandos. Adicionalmente, a través de medidas de los tiempos de relajación T1 y T2 y del coeficiente de difusión se caracterizó completamente la interacción observada en el experimento STD.

Finalmente, un estudio computacional que incluyó estudios de acoplamiento molecular y simulaciones de dinámica molecular en los sitios de unión del taxol y la colchicina fue llevado a cabo para establecer un modelo de unión ligando-receptor. Con esto se logró proponer que estos ligandos interactúan con la tubulina en el sitio de unión del taxol, encontrando interacciones con residuos clave de este sitio de unión, como la Thr276, His229 y Arg284. Así mismo, estas interacciones fueron observadas a lo largo de las simulaciones de dinámica molecular indicando una alta estabilidad en este sitio de unión.

De esta manera, este estudio se presenta como punto de partida para la identificación y optimización de los diterpenos de origen marino seleccionados, con el objetivo de mejorar sus propiedades antitumorales. También se resalta el poder que tienen la integración de estudios de interacción por RMN, con ensayos de actividad biológica in vitro y predicciones computacionales en la búsqueda de compuestos con actividad antitumoral.

Cancer is a group of diseases characterized by the uncontrolled growth and spread of abnormal cells to other tissues, that can result in the death of the patient. These diseases have a high prevalence, incidence and mortality worldwide. Currently there is a large therapeutic arsenal for the treatment of these diseases, however there is a constant need for new and more compounds for the effective treatment of these diseases.

Among the compounds from natural origin, diterpenes have proved to be useful for the treatment of cancer. Marine organisms, such as octocorals and algae, have been described as prolific producers of these diterpenes, making them a rich source of antitumor agents. As part of the studies made by the research group Estudio y aprovechamiento de productos naturales marinos y frutas de Colombia, on the diterpenes isolated from octocorals, the cytotoxic activity of a library composed of 32 members, of both natural and semi-synthetic origin, was evaluated against three human cancer cell lines, A549 (lung cancer), MCF7 (breast adenocarcinoma) and PC3 (prostate cancer) through the MTT cell viability assay. From these, three diterpenes with cytotoxic activity were selected by its activity against the three cell lines here evaluated, namely compounds 1, 17 and 26, whose presented values of inhibitory concentration 50 (IC50) lower than 30 μM.

In order to establish if the active compounds are apoptosis or necrosis inductors, the type of cytotoxic effect was evaluated through flow cytometry analysis using the Annexin V and 7AAD fluorochromes. The inhibitory concentrations IC25, IC50 and IC75 of each compound were evaluated against the cell line A549. Through the positive cell population analysis of each fluorochrome, it was possible to determine that the three compounds are apoptosis inductors in this cell line.

Then, in order to determine if the observed apoptosis was generated by an antimitotic effect, the interaction with tubulin of the three ligands was assessed by an NMR study. With the STD experiment it was possible to determine the binding epitopes of each ligand, and the relaxation measurements T1 and T2, along with diffusion measurements allowed completing the characterization of the interaction observed on the STD experiment.

Finally, a computational study using molecular Docking and molecular dynamics simulations at the binding sites of taxol and colchicine was carried out to establish a ligand-receptor model. These computational methods allowed proposing that the ligands interact with tubulin in the binding site of taxol by the observed interactions with key residues in this binding site, such as Thr276, His229 and Arg284. Likewise, these interactions were observed throughout the molecular dynamics simulations indicating a high stability in this binding site.

Finally, this study represents a starting point for the identification and optimization of selected marine diterpenes, with the aim of improving their antitumor properties. In addition, the power of the integration of NMR interaction studies, with in vitro and computational predictions in the search for compounds with antitumor activity is also highlighted in this work.