PKC en un microambiente leucémico con células stem mesenquimales: Su participación en el soporte, la supervivencia y los mecanismos que median la protección ante agentes quimioterapéuticos en células de pacientes con Leucemia Linfoide Aguda de precursores B

Abstract

El tratamiento de pacientes con Leucemia Linfoide Aguda (ALL) ha logrado unos porcentajes elevados y significativos de remisión completa. Sin embargo, un grupo reducido de pacientes recae, debido en parte a la presencia de células leucémicas residuales que escapan a la terapia. Las células madre mesenquimales (MSC) son importantes no sólo como soporte funcional para las células madre hematopoyéticas (HSC) sino también como un factor que promueve la supervivencia de las células leucémicas y el desarrollo de la enfermedad. La interacción entre las MSC y las células leucémicas desencadena la activación de diferentes vías de señalización, lo que lleva a la remodelación del denominado “nicho leucémico” y la supervivencia de las células leucémicas. La proteína quinasa C (PKC) es un factor importante que media el soporte de las MSC. Aquí se estudió el papel de PKC en un modelo in vitro de nicho leucémico, utilizando MSC de individuos sanos y células leucémicas de pacientes pediátricos con ALL-B (n = 22). Se empleó el péptido quimérico HKPS, como estrategia para inhibir la PKC tanto en las células ALL-B como en las MSC. En primer lugar, se determinó mediante ensayos con MTT una reducción en la viabilidad de las células ALL-B después de 2 h de tratamiento con 40 μM de HKPS; 7 de 22 muestras mostraron una mayor susceptibilidad al tratamiento con HKPS (casi un 50% de inhibición); 7 pacientes no fueron susceptibles a HKPS mientras que 8 pacientes mostraron una respuesta intermedia. En los co-cultivos se determinó que el pretratamiento de las MSC con HKPS no afectó significativamente la viabilidad de las MSC, pero abolió el efecto protector de las MSC en ALL-B. Se estableció que las interacciones célula a célula son esenciales para la viabilidad de las células de ALL-B. El tratamiento con Enzastaurina, un inhibidor comercial de PKC, redujo la adhesión celular; sin embargo, esta función se vio más afectada después del tratamiento con HKPS. Se encontró que ICAM-1 y VLA-5, moléculas que se sobreexpresaron en las MSC después del co-cultivo, fueron reguladas negativamente por HKPS, lo que explica la pérdida de adhesión de las células ALL-B y la pérdida de viabilidad. Además, se observaron cambios en la activación de las vías de señalización de FAK y AKT cuando las MSC fueron pretratadas con HKPS. Curiosamente, HKPS indujo la regulación negativa de las vías ERK y NF-κB que se activaron en respuesta a la quimioterapia. La inhibición de PKC en el soporte de MSC aumentó la susceptibilidad de las células leucémicas al tratamiento con Dexametasona, Vincristina y Metotrexate. HKPS también inhibió la actividad de aldehído deshidrogenasa en las MSC e indirectamente indujo un aumento en la actividad de los principales transportadores de fármacos de la familia ABC. Estos resultados demuestran la importancia de la comunicación intercelular en el nicho leucémico y el papel de la PKC en el soporte leucémico. El uso del péptido quimérico HKPS podría ser una nueva estrategia para aumentar la susceptibilidad a la terapia al afectar directamente la viabilidad de las células ALL-B y alterar las señales pro-supervivencia que a estas les confieren las MSC.

The treatment of patients with Acute Lymphoid Leukemia (ALL) has achieved significant high percentages of complete remission. However, a low percentage of patients relapses, due in part to the presence of residual leukemic cells that escape therapy. Mesenchymal stem cells (MSCs) have been described not only as a functional support for hematopoietic stem cells (HSC) but also as a promoting factor for leukemic cell survival and development of the disease. The interaction between MSC and leukemia cells triggers the activation of different signaling pathways, leading to remodeling of the so-called leukemic niche and survival of leukemic cells. Protein kinase C (PKC) has been described as an important factor in this MSC support. Here, we have studied the role of PKC in an in vitro leukemic niche model using MSC from healthy individuals and leukemic cells from pediatric ALL-B patients (n=22). A chimeric HKPS peptide, previously described, was employed as a strategy to inhibit PKC in both ALL-B cells and MSC. First, a reduction in the viability of ALL-B cells after 2 h of treatment with 40 μM of HKPS was determined by the MTT assay; 7 out of 22 samples showed an increased susceptibility to HKPS treatment (almost 50% inhibition); 7 patients were not susceptible to HKPS while 8 patients showed and intermediate response. In the co-culture system, we determined by flow cytometry that the pre-treatment of the MSC with HKPS did not significantly affect MSC viability, but it abolished the protective effect of MSC on ALL-B. We have established that cell-to-cell interactions are essential for ALL-B viability. The treatment with Enzastaurin, a commercial PKC inhibitor, reduced cell adhesion, but this function was more affected after the treatment with HKPS. It was found that ICAM-1 and VLA-5, molecules that were over-expressed in MSC after the co-culture, were down regulated by HKPS, explaining the loss of ALL-B cells adhesion. Furthermore, we have observed changes in the activation of FAK and AKT signaling pathways when MSC were pre-treated with HKPS. Interestingly, HKPS induced the down regulation of ERK and NF-κB pathways that were activated in response to chemotherapy. Inhibition of PKC in the MSC support increased the susceptibility of leukemic cells to treatment with Dexamethasone, Vincristine and Methotrexate. HKPS was also able to abolish the aldehyde dehydrogenase activity of MSC and indirectly to promote an increase in the activity of the main drug ABC transporters. Together, these results demonstrate the importance of intercellular communication in the leukemic niche and the role of PKC in leukemic support. We suggest that the use of the chimeric HKPS peptide could be a novel strategy for increasing susceptibility to therapy by directly affecting the viability of ALL-B cells and altering the pro-survival signals conferred to them by MSC.