Evaluación de la integridad y funcionalidad espermática post-descongelación del caballo criollo colombiano mediante el uso de antioxidantes y un inhibidor de la capacitación.
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Type
Trabajo de grado - Doctorado
Document language
EspañolPublication Date
2021-08Metadata
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La criopreservación de semen equino facilita su uso en programas de inseminación artificial y mejoramiento genético, independientemente de la ubicación, disponibilidad o estado del ejemplar equino. Adicionalmente, su uso se ha extendido al desarrollo de biotecnologías de la reproducción asistida y a procesos de producción de embriones tanto in vivo como in vitro. Sin embargo, con el semen criopreservado se han conseguido tasas más bajas de fertilidad comparadas con las obtenidas con semen refrigerado. A nivel mundial se llevan a cabos múltiples estudios enfocados a mejorar los procesos de congelación del semen equino y a encontrar sustancias que atenúen los daños producidos por el estrés oxidativo y el choque osmótico ocasionados por este proceso. Precisamente, para contribuir al conocimiento sobre moléculas que disminuyan el estrés de la célula espermática durante el proceso de congelación, disminuyendo el daño a su estructura, maquinaria molecular y fisiología, en este trabajo evaluamos el efecto de dos antioxidantes no enzimáticos, Quercetina (Q) y L-Ergotioneína (E) y un inhibidor de la PKA (H89), adicionados al diluyente de congelación seminal, sobre la integridad y funcionalidad espermática. Con este fin, en la posdescongelación, en la primera parte del estudio evaluamos la cinemática espermática, la integridad de membrana, y la capacidad de fertilización in vitro. Posteriormente, en la segunda parte se evaluó el estrés oxidativo y en la última fase se evaluó la viabilidad, actividad mitocondrial y la estabilidad de la membrana celular. Se utilizó el análisis espermático computarizado (CASA), el test hiposmótico, la fertilización heteróloga in vitro, la espectroflurimetría y la citometría de flujo. En los 6 grupos experimentales evaluados (Control, Q, E, H89, H89Q, H89E), en el primer estudio se evidenció que H89 disminuye la hiperactivación y Q incrementa BCF. Sin embargo, la combinación de ambas moléculas altera patrones cinemáticos importantes para llevar a cabo la fertilización. No se observaron diferencias estadísticas significativas entre tratamientos y el control en otros patrones cinemáticos, integridad de membrana o capacidad fertilizante. En la segunda parte se encontró que todos los tratamientos, excepto el H89 disminuyeron la cantidad de especies reactivas de oxígeno en el semen criopreservado, siendo Q el mejor tratamiento. Por otro lado, todos los tratamientos, excepto E disminuyeron la peroxidación lipídica con respecto al control, siendo mejor la combinación de H89 y Q. Aunque Q tuvo un efecto positivo en el decrecimiento de la peroxidación lipídica, su combinación con H89 mostró una reducción mayor, sugiriendo un efecto sinérgico con el H89. Por su parte, en la fase final se encontró que la combinación H89 + E tuvo una tendencia a mejorar la actividad mitocondrial alta. Sin embargo, ninguno de los seis tratamientos evaluados tuvo efecto estadístico significativo sobre la estabilidad de membrana, la viabilidad, contenido o captación de calcio y actividad mitocondrial. Con estos resultados se concluyó que la Q y E actúan como antioxidantes de manera diferencial para la protección del espermatozoide durante la criopreservación. Adicionalmente se encontró que la combinación Q y E con H89 muestra efectos contrastantes entre la cinemática y su capacidad antioxidante, alterando la primera, pero favoreciendo la segunda. Estos resultados abren una ventana de estudio en los mecanismos moleculares que pueden acompañar el sinergismo entre H89 con Q y E, explorar combinaciones de otras concentraciones de las tres moléculas y llevar a cabo estudios más extensos de las vías de señalización asociadas. (Texto tomado de la fuente)Summary
Equine semen cryopreservation is used in artificial insemination and genetic improvement programs, it does not depend on the location, availability or condition of the equine specimen. Its use has been extended to the development of biotechnologies of assisted reproduction and to embryo production processes both in vivo and in vitro. However, cryopreserved semen has lower fertility rates compared to those obtained with refrigerated semen. Worldwide, multiple studies have been focused on improving the freezing processes of equine semen and finding substances that mitigate the damage caused by oxidative stress and osmotic shock. In order to contribute to the knowledge about molecules that decrease the stress of the spermatic cell during the freezing process, reducing the damage to its structure, molecular machinery and physiology, in this work was evaluated the effect of two non-enzymatic antioxidants, Quercetin (Q) and L -Ergotioneine (E) and a PKA inhibitor (H89), added to the seminal freezing diluent, on sperm integrity and functionality. Subsequently, in the second part, oxidative stress was evaluated and in the last phase, viability, mitochondrial activity, and cell membrane stability were evaluated. Computerized sperm analysis (CASA), hyposmotic test, heterologous in vitro fertilization, spectrofluorimetry and flow cytometry were used. In the 6 experimental groups evaluated (Control, Q, E, H89, H89Q, H89E), in the first study it was shown that H89 decreases hyperactivation and Q increases BCF. However, the combination of both molecules alters important kinematic patterns to carry out fertilization. No significant statistical differences were observed between treatments and control in other kinematic patterns, membrane integrity or fertilizing capacity. In the second part, it was found that all treatments, except H89, decreased the amount of reactive oxygen species in cryopreserved semen, with Q being the best treatment. On the other hand, all the treatments, except E, decreased lipid peroxidation with respect to the control, the combination of H89 and Q being better. Although Q had a positive effect in the decrease of lipid peroxidation, their combination with H89 showed a greater reduction, suggesting a synergistic effect with H89. On the other hand, in the final phase it was found that the H89 + E combination had a tendency to improve high mitochondrial activity. However, none of the six treatments evaluated had a statistically significant effect on membrane stability, viability, calcium content or uptake, and mitochondrial activity. With these results, it was concluded that Q and E act as antioxidants in a differential way for the protection of sperm during cryopreservation. In addition, it was found that the combination Q and E with H89 shows contrasting effects between the kinematics and its antioxidant capacity, altering the first, but favoring the second. These results open a window of study in the molecular mechanisms that can accompany the synergism between H89 with Q and E, to exploring combinations of other concentrations of the three molecules and and carry out more extensive studies of associated signaling pathways.Keywords
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