Evaluación del efecto de la fuerza centrífuga en la eficiencia de la transfección de células madre mesenquimales de cordón umbilical

Abstract

Una célula estromal mesenquimal humana (hCEM) es una célula madre adulta caracterizada por su capacidad de autorrenovación y diferenciación. También presentan varias ventajas tales como propiedades inmunomoduladoras que las hacen promisoria fuente en medicina regenerativa. Por lo tanto, el uso de estas células como portadoras de genes ha sido uno de los principales focos de varios estudios. En los últimos años, los vectores no virales todavía presentan algunas limitaciones, siendo la m[as importante las bajas eficiencias de transfección en las CEM. Se ha teorizado que esta baja eficiencia es causada por múltiples factores relacionados con las propiedades de las nanopartículas, incluyendo el tamaño, la carga, la degradación, el escape endosomal y el transporte del cergo al núcleo. Además, se ha demostrado que el tipo de célula y la fase del ciclo celular son una incidencia importante en la entrega de genes. En resumen, la transfección depende directamente de la naturaleza química del material (vector) que cubre el gen y su interacción no específica con todas las vías dentro de la célula. Por lo tanto, en este estudio probamos la hipótesis de que la eficiencia de la transfección génica está limitada principalmente por una barrera física simple: baja concentración de genes (ADN) en la superficie de la célula. Empleamos la centrifugación durante el proceso de transfección como un medio para aumentar más la disponibilidad de ADN en las proximidades de la membrana celular, generando así mayores eficiencias de transfección con el vector dorado no viral: PEI 25kDa. Además, una comprensión más profunda del mecanismo de transfección con este tipo de vectores permitió la estandarización de un nuevo y sencillo protocolo de transfección en el que se evaluaron la relación de peso, diferentes concentraciones de complejo, pH y número de paso para obtener tasas de transfección superiores al 25-30% con un método no viral. Por otro lado, nuestros resultados muestran que el efecto combinado de la centrifugación y la transfección tiene un impacto importante en la actividad metabólica de las MSC y la proliferación celular. (Texto tomado de la fuente)

A human mesenchymal stromal cell (hMSC) is an adult stem cell characterized by its self-renoval and differentiation capacity. They also present several advantages such immunomodulatory properties which make them promissory for regenerative medicine. Thus, using these cells as gene carriers has been one of the main focuses of several studies. In recent years, non-viral carriers still exhibit some limitations, namely low transfection efficiencies in MSCs. It has been theorized that this low efficiency is caused by multiple factors regarding nanoparticle properties, including size, charge, degradation, endosomal escape, and transport to the nucleus. Moreover, the cell type and the phase cell cycle have been proven to be an important incidence in the gene delivery. In brief, transfection depends directly on the chemical nature of the material (vector) which covers the gene and its non-specific interaction with all the pathways within the cell. Therefore, in this study we tested the hypothesis that the efficiency of gene transfection is mainly limited by a simple physical barrier: low concentration of gene (DNA) on the surface of the cell. We employed centrifugation during the transfection process as a means to increase more the availability of DNA in the vicinity of the cell membrane, thus generating higher transfection efficiencies with non-viral golden vector: PEI 25kDa. Additionally, a deeper understanding of the transfection mechanism with these types of vectors enabled the standardization of a new and simple transfection protocol in which the weight ratio, different concentrations of complex, pH and passage number were evaluated to obtain transfection rates above 25-30% with a non-viral method. On the other hand, our results show that the combined effect of centrifugation and transfection has an important impact in MSCs metabolic activity and cell proliferation.