Estudio de la nicotinamida/nicotinato mononucleótido adenilil transferasa de leishmania braziliensis (LbNMNAT): Hacia la caracterización de un potencial blanco quimioterapéutico

Abstract

La leishmaniasis es un problema de salud pública en los países donde se presenta de manera endémica [1]. La búsqueda de fármacos de baja toxicidad para el paciente y la identificación de nuevos blancos terapéuticos, han sido unas de las estrategias de lucha en contra de esta parasitemia. El Laboratorio de investigaciones básicas en bioquímica (LIBBIQ), ha concentrado su interés en el metabolismo del Dinucleótido de Nicotinamida y Adenina (NAD+) en Leishmania braziliensis, específicamente en la enzima central de su metabolismo, la Nicotinamida Mononucleotido Adenilil Transferasa (LbNMNAT). Resaltando sus características como posible blanco terapéutico por su papel fundamental en el metabolismo del parásito y su supervivencia [2]. Por ello se consideró de relevancia continuar con la caracterización de la LbNMNAT, una enzima central en el metabolismo del NAD+. En este trabajo se emplearon diversas estrategias metodológicas bioinformáticas y experimentales. Inicialmente se emplearon promastigotes para evaluar el efecto que tendrían algunos derivados imidazolicos sobre su viabilidad, para ello se empleo el método colorimétrico (MTT), hallando efecto con el ketoconazol con un IC50 de 27,9 μM; también se planteó una propuesta metodología utilizando la Proteína verde fluorescente para evaluar estos efectos [3], [4]. Se generaron proteínas recombinantes para analizar el efecto de los derivados imidazolicos sobre la actividad catalítica de la LbNMNAT. Se encontró inhibición con los derivados benzimidazólicos (fenbendazol y el mebendazol) en concentraciones micromolares, lo cual podría estar relacionado con las bajas energías de unión que fueron predichas en el acoplamiento molecular para estos compuestos. Finalmente, en busca de caracterizar estructuralmente a la LbNMNAT, se analizó el efecto de la fosforilación como mecanismo de regulación enzimática; empleando análisis bioinformáticos, se predijo el residuo serina 210 como el sitio más probable de ser fosforilado. V Para el estudio de la fosforilación de la LbNMNAT se emplearon herramientas de biología molecular; mediante mutagénesis dirigida se generó el mutante fosfomimético LbNMNAT S210D, el cual corresponde a una región especifica de la proteina del parásito. El análisis del efecto de la mutación fosfomimética sobre la actividad adenilil transferasa de la enzima, evaluado por ensayos enzimáticos directos (RP-HPLC), no mostro diferencias respecto a la proteina nativa. Sin embargo, es necesario explorar el efecto que podría tener esta modificación sobre otras posibles funciones de la Lb-NMNAT, que se encuentran en investigación tales como la actividad chaperona. (Texto tomado de la fuente)

Leishmaniasis is a public health problem in countries where it is endemic [1]. The search for drugs with low toxicity for the patient and the identification of new therapeutic targets have been some of the strategies to combat this parasitemia. The Basic Research Laboratory in Biochemistry (LIBBIQ) has focused its interest on the metabolism of Nicotinamide Adenine Dinucleotide (NAD+) in Leishmania braziliensis, specifically on the central enzyme of its metabolism, Nicotinamide Mononucleotide Adenylyl Transferase (LbNMNAT). Highlighting its characteristics as a possible therapeutic target due to its fundamental role in the metabolism of the parasite and its survival [2]. For this reason, it was considered relevant to continue with the characterization of LbNMNAT, a central enzyme in the metabolism of NAD+. Various bioinformatics and experimental methodological strategies were used in this work. Initially, promastigotes were used to evaluate the effect that some imidazole derivatives would have on viability. For this, the colorimetric method (MTT) was used, finding an effect with ketoconazole with an IC50 of 27.9 μM; A proposed methodology using Green Fluorescent Protein to assess these effects was also put forward [3], [4]. Recombinant proteins were generated to analyze the effect of imidazolic derivatives on the catalytic activity of LbNMNAT. Inhibition was found with benzimidazole derivatives (fenbendazole and mebendazole) at micromolar concentrations, which could be related to the low binding energies that were predicted in docking molecular for these compounds. Finally, seeking to structurally characterize LbNMNAT, the effect of phosphorylation as an enzymatic regulation mechanism was analyzed; using bioinformatic analyses, the serine 210 residue was predicted as the most likely site to be phosphorylated. Molecular biology tools were used to study the phosphorylation of LbNMNAT; through site-directed mutagenesis, the phosphomimetic mutant LbNMNAT S210D was generated, which corresponds to a specific region of the parasite protein. The analysis of the effect of the phosphomimetic mutation on the adenylyl transferase activity of the enzyme, evaluated VII by direct enzymatic assays (RP-HPLC), did not show differences with respect to the native protein. However, it is necessary to explore the effect that this modification could have on other possible functions of Lb-NMNAT, which are under investigation, such as chaperone activity.