Caracterización genómica de Staphylococcus aureus susceptibles a meticilina con efecto inóculo en Colombia
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Autores
Soto Guzmán, Fredi Giovanni
Director
Reyes Manrique, Jinnethe Cristina
Reguero Reza, María Teresa Jesús
Tipo de contenido
Trabajo de grado - Maestría
Idioma del documento
EspañolFecha de publicación
2022-12
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Resumen
Staphylococcus aureus (S. aureus) es un microorganismo versátil, que puede ser
colonizador de la piel y las mucosas de los vertebrados, siendo también capaz de causar
enfermedades graves en los hospederos. Aunque se describe mundialmente el aumento
de los aislamientos de S. aureus resistentes a meticilina (MRSA por sus siglas en inglés),
las cepas de S. aureus sensibles a meticilina (MSSA por sus siglas en inglés) continúan
produciendo infecciones graves, que causan una morbimortalidad alta. La presencia de
efecto inóculo a cefazolina es un fenómeno descrito desde hace aproximadamente 50 años,
pero poco estudiado y comprendido. Comprobar que una infección por S. aureus meticilino
sensible es causada por una cepa con presencia de este fenómeno de manera rápida, no
es posible con metodología estándar y tampoco se conoce demasiado sobre los factores
de resistencia y virulencia asociados en estas cepas. La presencia del efecto inóculo, puede
hacer inútil el tratamiento con cefazolina cuando de forma empírica se utiliza o cuando con
resultado del antibiograma, es reportada como sensible a este antibiótico, llevando a falla
terapéutica.
El presente estudio tiene como objetivos: i) establecer la prevalencia de efecto inóculo a
cefazolina en 186 aislamientos de MSSA provenientes de hemocultivos positivos
(bacteriemia) de pacientes colombianos entre los años, 2011 a 2013, ii) identificar cambios
genéticos específicos asociados al efecto inóculo en el operón blaZ e iii) identificar genes
de resistencia a diferentes tipos de antibióticos y genes de virulencia en estas cepas.
Las MIC para Cz fueron determinadas con inóculos bacterianos estándar de 5 x 105
UFC/mL y alto inóculo de 5 x 107 UFC/mL, por microdilución en caldo BHI, que se dejaron
en incubación por 24 horas a temperatura de 37ºC. Se utilizaron rangos entre 0.0625 µg/mL,
hasta 64 µg/ml. Se dejaban estas placas en incubación y se realizó la lectura e interpretación adecuada. Este experimento se repitió tres veces con cada cepa y la
observación de cada pozo fue realizada por tres observadores diferentes. Se consideró que
existía el EICz en aquellas cepas con una concentración mayor o igual a 16 µg/mL. El
control de calidad se realizó utilizando cepas de referencia como i) la cepa TX0117, la cual
es productora de alta cantidad de b - lactamasa tipo A con MIC de > 64 µg/mL; ii) la cepa
ATCC29213, cepa productora de pequeña cantidad de b - lactamasa tipo A con MIC de 2 a
4 µg/mL y iii) la cepa ATCC25923, cepa b - lactamasa negativa con MIC de 0.25 a 0.5
µg/mL. A estas cepas se les realizo la extracción de DNA, empleando el estuche comercial
DNeasey Blood & Tissue Kit, Quiagen y la cuantificación del ADN genómico se realizó por
flurometría empleando Qubit 2.0, la preparación de librerías se utilizó el estuche comercial
Nextera XT (illumina); su verificación se hizo con fluorometría (Qubit 2.0) y se empleó el
equipo Agilent 2100 Bioanalyzer para su normalización y la secuenciación genómica se
realizó en la plataforma illumina (MiSeq). Las lecturas de secuenciación fueron procesadas
eliminando posibles contaminaciones y descartando lecturas de baja calidad mediante
Trimmomatic; las lecturas fueron reensambladas con SPAdes y anotadas con RAST. Las
búsquedas de cada genoma se realizaron con el programa BLASTX, contra las bases de
datos ResFinder y VFDB. En la determinación de la secuenciación de blaZ, para identificar
diferencias específicas de los aminoácidos en los residuos 128 – 216, se realizó a partir de
un lineamiento múltiple de secuencias de la proteína con MUSCLE. El resistoma y el
viruloma se realizó de acuerdo a la búsqueda en los genomas de 3078 genes de resistencia
y 3659 de genes de virulencia en plataformas de información como ResFinder y Virulence
factors database.
De los 186 aislamientos, 73 (39%) tenían presencia del efecto inóculo (EI) a cefazolina (Cz)
[EICz], mientras que 113 aislamientos (61%) no lo tenían. Las b - lactamasas más
asociadas a la presencia del EICz fueron la tipo A y la C y los alotipos BlaZ – 2 y BlaZ – 1
pertenecientes a los “complejos clonales (CC)” 30 y 8, respectivamente, adicional fueron
los alotipos con mayor probabilidad de presentar el fenómeno estudiado. En las cepas sin
EICz, se encontró que la b - lactamasa tipo B fue la más asociada a ausencia del fenotipo.
Los alotipos más frecuentes fueron BlaZ – 3, BlaZ – 5 y BlaZ – 7 y los CC5, CC8 y CC1
fueron los más detectados en este grupo. En 24 de las 73 cepas con presencia del EICz,
(32%) se encontró al menos un gen de resistencia a otros antibióticos como: parC para
quinolonas, rpoB para rifampicina, ant(9) - Ia para aminoglicósidos, tet(K) para tetraciclinas y erm(A) para macrólidos que no son antibióticos considerados de primera línea para el
tratamiento de infecciones por MSSA. En ausencia del EICz, 93 de 113 cepas (82%), se
encontró al menos un gen de resistencia de los ya mencionados, junto con otros como fusB
de resistencia al ácido fusídico, dfrA8 de resistencia al trimetoprim y más enzimas
modificadores de aminoglicósidos como aadD, aph(3´) – III, además, el gen rpoB no fue
encontrado en este grupo de aislamientos sin el fenotipo. Los genes de virulencia muestran
más diferencias entre los aislamientos con y sin presencia del efecto, pero la mayoría de
ellas coinciden en la ausencia de genes como los asociados a la producción de leucocidinas
como PVL, enterotoxinas, toxinas exfoliativas, coagulasa entre otros. En todas las cepas,
se identificó el sistema regulador de genes accesorios (agr) y su relación con presencia o
ausencia de EICz.
A partir de este trabajo se pudo concluir que la frecuencia del EICz en Colombia es de 39%,
siendo las b – lactamasas tipo A y C y los alotipos BlaZ – 2 de la b – lactamasa tipo A y
BlaZ – 1 de la b – lactamasa tipo C las más frecuentes. Se observó muy baja prevalencia
de genes de resistencia a otros antibióticos diferentes de los B-láctamicos en las cepas con
presencia de EICz. En cuanto a la virulencia, todas ellas presentaron gran cantidad y
diversidad de genes. En cuanto a las cepas que presentaron ausencia del fenotipo
correspondieron al 61% y esta se observó principalmente en aislamientos con b –
lactamasa tipo B. Los alotipos BlaZ – 3, BlaZ – 5 y BlaZ – 7 fueron los más frecuentes en
cepas sin EICz. Se encontraron genes de resistencia a otros antibióticos en mayor
frecuencia y tenían gran cantidad y variedad de genes de virulencia en cepas sin presencia
del EIC, lo cual muestra que no existe ninguna relación entre su perfil de resistencia y
virulencia y la presencia del fenotipo. Finalmente, el sistema agrIII se relacionó más con la
presencia de EICz, mientras que el sistema agrII se relacionó con la ausencia de EICz. (Texto tomado de la fuente)
Abstract
Staphylococcus aureus (S. aureus) is a versatile microorganism that colonizes the human
skin and nasal mucous, as well as cause serious host infectious diseases. Although the
increase of methicillin-resistant S. aureus (MRSA) isolates is reported worldwide, the
methicillin-sensitive S. aureus (MSSA) continues to cause serious infections and high
morbidity and mortality. The presence of cefazolin inoculum effect (CzIE) is a phenomenon
described for approximately 50 years ago, but its mechanism is unknown. The presence of
this phenomenon is not possible with standard methodology and neither is much known
about the resistance and virulence factors associated with these strains. The presence of
the CzIE may render treatment with cefazolin useless when it is used empirically or when
as a result of the antibiogram is reported as sensitive leading to therapeutic failure.
The aims of this study are: i) to establish the prevalence of the CzIE in 186 MSSA isolates
from bloodstream cultures (bacteremia) of Colombian patients between 2011 to 2013, ii)
identify specific genetic changes associated with the CzIE in blaZ operon and iii) identify
resistance genes to different antibiotics groups and virulence genes in these strains.
MICs for Cz were determinated with standard bacterial inoculum of 5 x 105 CFU/mL and
high inoculum of 5 x 107 CFU/mL, by microdilution in BHI broth, which were left in incubation
for 24 hours at a temperature of 37ºC. For all strains, 5µL were served in plates with Cz.
The initial concentration of the antibiotic was 10.000µg/mL, from which dilutions were made
to obtain concentrations of 0.0625 µg/mL, up to 64µg/ml. Of each antibiotic preparation,
95µL were taken. These plates were incubated for 24 hours and the appearance of a
precipitate or where there was a significant turbidity of the same was observed. This
experiment was repeated three times with each strain and the observation of each one was
carried out by three different observers. EICz was considered to exist when a precipitate
appeared at MIC ³ 16 µg/mL. These strains underwent nucleic acid extraction, libraries
preparation and genomic sequencing. Three of the rows of the plates were used to collect
control strains for high inoculum. The strains were TX0117: high – quantity producer type A
b – lactamase with MIC > 64 µg/mL, ATCC29213: small – quantity producer type A b –
lactamase with MIC is 2 to 4 µg/mL and ATCC25923, strain b – lactamase negative with MIC of 0.25 to 0.5 µg/mL. DNA extraction was performed using the commercial DNeasy
Blood & Tissue Kit, Quiagen. Genomic DNA quantification was performed by fluorometry
using the Qubit 2.0 Fluorometer. Genomic libraries were prepared using the commercial
Nextera XT kit (illumina). The verification was done with fluorometry (Qubit 2.0) and the
Agilent 2100 Bioanalyxer equipment was used for its normalization. Genomic sequencing
was performed on the Illumina platform in MiSeq equipment, to obtain paired sequences of
250 nucleotides. Reading sequences were processed to remove library contamination and
discard poor quality read by Trimmomatic. The readings were reassembled with SPAdes
and annoted with RAST. The searches of each genome were carried out with the BLASTX
program with ResFinder and VFDB databases. Sequencing of a blaZ fragment to identify
aminoacidic differences at residues 128 – 216 was performed from a multiple lining of protein
sequences with MUSCLE. The resistome and the virulome were performed according to the
search in the genomes of 3078 resistance genes and 3659 genes of virulence from
information platforms such as ResFinder and Virulence factor database.
Out of the 186 isolates, 73 (39%) had the presence of the CzIE, while 113 isolates (61%)
did not. The b - lactamases types more associated with the presence of the effect were types
A and C and the allotypes BlaZ – 2 of b - lactamase type A and BlaZ – 1 of b - lactamase
type C (belonging to clonal complex or “CC” 30 and 8, respectively), showed the highest
probability of presenting the effect.
In strains without the effect, it was found that b - lactamase type B were the most associated
with the absence of the effect. The most frequent allotypes were BlaZ – 3, BlaZ – 5 and BlaZ
– 7. The CC5, CC8 and CC1 were the most isolated in this group.
Twenty - four of the 73 strains with EICz (32%), showed at least one gene for resistance to
other antibiotics such as macrolides, lincosamides, aminoglycosides, tetracyclines and
quinolones was found, which are not antibiotics considered first – line for the treatment of
infections by MSSA. Most were found in isolates with type A b - lactamase. Some genes
founded were ParC for quinolones, rpoB for rifampicin, ant(9) – Ia for aminoglycosides, tet(K)
for tetracyclines and ermA for macrolides. Ninety – three of the 113 strains without EICz, (82%), showed at least one resistance gene,
to mor groups of antibiotics such as macrolides, lincosamides, aminoglycosides,
tetracyclines, quinolones and fusidic acid. Most were found in isolates with type B b -
lactamase. With the exception of rpoB gene that wasn´t found in this group, along with those
already mentioned, genes such fusidic acid resistance fusB, trimethoprim resistance dfrA8
and other aminoglycosides modifying enzymes such as aadD, aph(3´)-III were found. The
virulence genes show more differences between the isolates with and without the presence
of the effect, but most of them coincide in the absence of genes such as those associated
with the production of leukocidins such as PVL, enterotoxins, exfoliative toxins, coagulase
and others.
In all strains, the accessory gene regulatory system (agr) and its relationship with the
presence or absence of EICz were identified.
Conclusions:
The frequency of EICz in the studied strains was 39%, being the type A and C b -
lactamases, the most associated. The allotypes BlaZ – 2 of the type A b - lactamase and
BlaZ – 1 of type C b - lactamase were the allotypes where the presence of EICz was found
mainly.
The few genes for resistance to other antibiotics found in strains with presence of EICz were
found in isolates with BlaZ – 2 allotype of the type A b - lactamase and BlaZ – 1 of type C b
- lactamase. In addition, all of them present a large number and diversity of virulence genes.
The absence of EICz was 61% and this was observed in isolates with type B b - lactamase
mainly. The allotypes BlaZ – 3, BlaZ – 5 and BlaZ – 7 of type B b - lactamase were the
allotypes where the absence of EICz was found more frequently.
More genes of resistance to other antibiotics were found in strains without the EICz in
allotypes BlaZ – 3, BlaZ – 5 and BlaZ -7. Therefore, the absence of the EICz, does not mean
the absence of other mechanism of antibiotic resistance.
The agrIII system was more related to the presence of EICZ, while the agrII system was
related to the absence of EICz.
Descripción Física/Lógica/Digital
ilustraciones, diagramas