Evaluación de nuevas tecnologías para el estudio de función génica en Pseudocercospora fijiensis con potencial para el manejo de la Sigatoka Negra en el cultivo del banano.

Abstract

Este estudio evaluó el uso de la tecnología RNAi y CRISPR-Cas9 para mejorar el manejo de la Sigatoka Negra en el banano. Se sintetizaron secuencias de RNA de doble cadena cortas (siRNA) que silenciaron los genes PfFus3, PfAC y PfCYP51 y se aplicaron en ascosporas y fragmentos miceliales. También se sintetizaron secuencias de RNA de doble cadena largas (double-stranded RNA, dsRNA), y se evaluaron en los mismos materiales fúngicos en condiciones in vitro. Las secuencias de dsRNA con mejor inhibición in vitro y las secuencias de siRNA se aplicaron en plantas de banano susceptibles, encapsuladas en hidróxidos dobles laminares (layered double hydroxide, LDH) y sin nanoencapsular, para evaluar su efecto protector contra la enfermedad. Adicionalmente, se investigó el uso de CRISPR-Cas para la edición de genes en P. fijensis, utilizando un vector con la enzima Cas9 y un RNA guía (gRNA) dirigido al gen escitalona deshidratasa (SCD1), implicado en la síntesis de melanina, permitiendo observar un cambio visual en el fenotipo de los transformantes.

Los resultados mostraron que las secuencias de siRNA causaron una inhibición del crecimiento de los tubos germinativos. La eficiencia de ingreso de las secuencias de siRNA en micelio a través del método de polietilenglicol fue de 62 ± 4.4 %. La transfección de estas secuencias en micelio usando este método provocó una disminución del crecimiento micelial, una reducción en los niveles de expresión génica y una menor severidad de la infección en hojas de banano. Además, los siRNA dirigidos contra el gen PfCYP51 lograron reducir la tolerancia al propiconazol en una cepa de P. fijiensis resistente a los azoles, en condiciones in vitro. De manera similar, las secuencias de dsRNA homólogas a los genes PfCYP51 y PfFus3 inhibieron la longitud del tubo germinativo, los niveles de expresión de los genes objetivo y la patogenicidad en P. fijiensis. Tanto las secuencias de siRNA como las de dsRNA mostraron eficacia en la inhibición de la infección cuando se aplicaron a plantas de banano susceptibles, ya sea encapsuladas en LDH o sin encapsular. Adicionalmente, la edición de P. fijiensis utilizando el sistema CRISPR-Cas resultó en la obtención de colonias de color blanco, lo que indica una alteración en el proceso de producción de melanina. Aunque el cambio fenotípico indica que la edición fue en parte exitosa, no se detectaron modificaciones en la secuencia genómica mediante secuenciación; sin embargo, se observaron cambios en los niveles de expresión génica. Este resultado podría deberse a una edición parcial en la que solo algunos núcleos del hongo fueron editados. Este estudio sugiere que la RNAi y CRISPR-Cas9 tienen potencial como herramientas para el manejo y estudio de P. fijiensis. Sin embargo, se requieren optimizaciones adicionales para la aplicación práctica del RNAi en agricultura y para mejorar la eficiencia de entrega y precisión de la edición genética mediante CRISPR-Cas9. (Texto tomado de la fuente)

This study evaluated the use of RNAi and CRISPR-Cas9 technologies to improve the management of Black Sigatoka in banana. Short double-stranded RNA (siRNA) sequences were synthesized to silence the genes PfFus3, PfAC, and PfCYP51, and applied to ascospores and mycelial fragments. Long double-stranded RNA (dsRNA) sequences were also synthesized and tested on the same fungal materials under in vitro conditions. The dsRNA sequences with the best in vitro inhibition and the siRNA sequences were applied to susceptible banana plants, both encapsulated in layered double hydroxides (LDH) and non-encapsulated, to evaluate their protective effect against the disease. Additionally, the study explored the use of CRISPR-Cas for gene editing in P. fijiensis, employing a vector with the Cas9 enzyme and a guide RNA (gRNA) targeting the scytalone dehydratase (SCD1) gene, which is involved in melanin synthesis, allowing a visual change in the phenotype of the transformants.

The results showed that siRNA sequences caused inhibition of germ tube growth. The siRNA uptake efficiency in mycelium using the polyethylene glycol method was 62 ± 4.4%. Transfecting these sequences into mycelium with this method led to reduced mycelial growth, lowered gene expression levels, and decreased infection severity on banana leaves. Additionally, siRNAs targeting the PfCYP51 gene successfully reduced tolerance to propiconazole in an azole-resistant P. fijiensis strain under in vitro conditions. Similarly, dsRNA sequences homologous to the PfCYP51 and PfFus3 genes inhibited germ tube length, target gene expression levels, and pathogenicity in P. fijiensis. Both siRNA and dsRNA sequences effectively inhibited infection when applied to susceptible banana plants, either encapsulated in LDH or non-encapsulated. Furthermore, CRISPR-Cas editing of P. fijiensis resulted in the production of white colonies, indicating an alteration in the melanin production pathway. Although the phenotypic changes suggested effective editing, no genomic sequence alterations were detected through sequencing; however, changes were observed in gene expression levels. This outcome could be due to partial editing, where only some of the fungus’s nuclei were edited. This study suggests that RNAi and CRISPR-Cas9 have potential as tools for managing and studying P. fijiensis. However, further optimization is required for the practical application of RNAi in agriculture and to improve delivery efficiency and editing precision of the CRISPR-Cas9 system.