Estudio del papel de la expresión de las citocinas humanas recombinantes IL-6 e IL-8 en modelos de cáncer hematológico de buen y mal pronóstico
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Resumen
Las citoquinas proinflamatorias IL-6 e IL-8 tienen un papel fundamental en el establecimiento y regulación del nicho leucémico (NL) al modificar las propiedades biológicas de las células estromales mesenquimales (MSC). En la leucemia linfoide aguda de precursores de células B (LLA-B) estas modificaciones son responsables en parte de la progresión tumoral y de la quimiorresistencia. En este trabajo se estudió el efecto en conjunto de estas citoquinas sobre las funciones y características de las MSC derivadas de sangre de cordón umbilical (MSC-SCU) y de la gelatina de Wharton (MSC-WJ), con énfasis en las modificaciones inducidas en las MSC durante la interacción con las líneas celulares de LLA-B de buen (REH) y mal pronóstico (SUP-B15) en modelos de co-cultivo in vitro, y su efecto sobre la quimiorresistencia de las células de LLA-B. Se observó que el tratamiento de las MSC-WJ con IL-6 e IL-8 por 48 h, aumentó su capacidad de autorrenovación (el doble de esferas, cuatro veces más grandes que el control). Este tratamiento con citoquinas también indujo un incremento de 4 veces en la capacidad clonogénica de las MSC-WJ, y un aumento de su capacidad de diferenciación adipogénica (125%) y condrogénica (40%). En el contexto de NL, las dos líneas celulares disminuyeron la autorrenovación inducida por IL-6 e IL-8, pero las células REH la disminuyeron un 75% mientras que las SUP-B15 solo un 50%. El pre-tratamiento de las MSC-WJ con IL6 e IL8, no modificó el efecto de las líneas leucémicas sobre la autorrenovación, sugiriendo que el efecto inhibitorio, por parte de las células leucémicas, es más fuerte que el efecto inductor de la autorrenovación de las citoquinas IL-6 e IL-8. Esto señala la relevancia del efecto paracrino que tiene el secretoma sobre la autorrenovación en el microambiente del NL. Asimismo, el MC del NL de REH disminuyó de manera significativa más la capacidad clonogénica que el MC del NL de SUP-B15 (85% vs 25%) de las MSC-WJ pretratadas con las dos citoquinas, confirmando que el efecto inhibitorio del NL sobre la autorrenovación de las MSC es más fuerte que el inducido por las citoquinas. Por otra parte, no hubo diferencias entre las dos líneas leucémicas en la diferenciación adipogénica de MSC pre-tratadas con citoquinas. Por el contrario, las SUP-B15 si indujeron una mayor diferenciación condrogénica que las REH. Esto muestra que existe una modulación diferencial de la diferenciación por parte de las citoquinas dependiente del linaje mesenquimal involucrado.
Los MC de REH y de SUP-B15 indujeron senescencia en MSC al día 3, pero sin diferencias significativas entre ambos. No obstante, la senescencia de las MSC con el MC de REH disminuyó en el tiempo, mientras que la del MC de SUP-B15 se mantuvo elevada hasta el día 9. La caracterización del secretoma mostró, en concordancia con lo anterior, una mayor secreción de citoquinas pro-inflamatorias por parte de las células SUP-B15. De interés, IL-6, IL-8 y MIF se secretaron abundantemente (2 veces más para IL-6 e IL-8, y cuatro veces más para MIF) en NL de SUP-B15 que en el NL de REH. La exposición prolongada de las MSC a IL-6 e IL-8 produjo desde el día 3 un aumento de células senescentes (SA-β-Gal positivas), acompañado de una disminución de la proliferación y cambios morfológicos compatibles con un proceso senescente. Al día 6 y 9, las células positivas para SA-β-Gal fueron el doble de las del día 3. No se evidenció una activación directa de NF-κB, pero el uso de un inhibidor específico de NF-κB sugirió su participación en la inducción de la senescencia y la autorrenovación de las MSC.
Finalmente, se evaluó el efecto del pre-tratamiento de MSC-SCU con IL-6 e IL-8 en la quimiorresistencia a varios fármacos. No se observaron diferencias entre las MSC-SCU pre-tratadas o no con IL-6 e IL-8 para ninguna de las líneas celulares, ni para los tratamientos con doxorrubicina (DOXO) y vincristina (VCR). Por el contrario, se evidenció un efecto diferencial en la resistencia al metrotexato (MTX), ya que el pre-tratamiento con IL-6 e IL-8 redujo significativamente la viabilidad de REH (de 70% a menos de 50%) y de SUP-B15 (de 100% a 80%), mostrando que las citoquinas atenúan el efecto protector de las MSC. Se destaca que esto fue cierto solo para las MSC aisladas de SCU y no para las aisladas de WJ. Las células REH co-cultivadas con células pretratadas con citocinas e inducidas a diferenciarse a adipocitos mostraron un aumento en su viabilidad a las dos concentraciones de MTX utilizadas. Este efecto no se vió en las células SUP-B15. La diferenciación condrogénica, indujo una disminución de la protección del NL en las células REH, pero sin diferencias entre el tratamiento o no con citoquinas. Este efecto también se vió en las SUP-B15 aunque en un rango menor. Esto muestra que el efecto de la diferenciación a linajes mesenquimales define en parte la mayor o menor resistencia a algunos quimioterapéuticos.
Nuestros resultados demuestran que las citoquinas IL-6 e IL-8 favorecen la autorrenovación y la clonogenicidad de las MSC y alteran su diferenciación multipotente. Además, inducen un proceso de senescencia y una expresión diferencial de secretoma dependiente de la agresividad del subtipo leucémico. También se muestra que el NL es un microambiente muy cambiante, y que las MSC presentan una alta capacidad de reprogramación que puede modular de manera diferencial la respuesta de las células leucémicas a la quimioterapia. Esta reprogramación de las MSC se da por su interacción con las células leucémicas y la inducción de un secretoma rico en citoquinas pro-inflamatorias como IL-6 e IL-8, con la concomitante inducción de un proceso de senescencia celular, la diferenciación hacia linajes específicos, y la modulación de la quimiorresistencia. Debido a que las propiedades intrínsecas de las células leucémicas y su interacción con las MSC difieren entre subtipos de buen (REH) y mal pronóstico (SUP-B15), esta reprogramación será disímil entre ellas, al igual que la quimiorresistencia. Estos hallazgos contribuyen al conocimiento del papel de las MSC en la LLA-B, en particular por la dinámica y evolución de las funciones de las MSC en el NL, y permiten concebir estrategias para intervenir el soporte estromal y así contrarrestar la quimiorresistencia y mejorar, eventualmente, el transcurso de la enfermedad. (Texto tomado de la fuente)
Abstract
Proinflammatory cytokines IL-6 and IL-8 play a fundamental role in the establishment and regulation of the leukemic niche (LN) by modifying the biological properties of mesenchymal stem cells (MSC). In precursor B-cell acute lymphoblastic leukemia (B-ALL), these modifications are partly responsible for tumor progression and chemoresistance. In this work, the combined effect of these cytokines on the functions and characteristics of mesenchymal stem cells derived from umbilical cord blood (UCB-MSC) and Wharton's jelly (WJ-MSC) was studied, with an emphasis on the modifications induced in MSC during interaction with good (REH) and poor prognosis (SUP-B15) B-ALL cell lines in vitro co-culture models, and their effect on the chemoresistance of B-ALL cells. It was observed that treatment of WJ-MSC with IL-6 and IL-8 for 48 hours increased their self-renewal capacity (twice the number of spheres, four times larger than the control). This treatment with cytokines also induced a fourfold increase in the clonogenic capacity of MSC-WJ, and an increase in their adipogenic (125%) and chondrogenic (40%) differentiation capacities. In the context of NL, both cell lines reduced IL-6 and IL-8 induced self-renewal, but the REH cells reduced it by 75% while the SUP-B15 cells only by 50%. The pre-treatment of MSC-WJ with IL6 and IL8 did not modify the effect of the leukemic lines on self-renewal, suggesting that the inhibitory effect by the leukemic cells is stronger than the self-renewal-inducing effect of the cytokines IL-6 and IL-8. This highlights the relevance of the paracrine effect that the secretome has on self-renewal in the NL microenvironment. Likewise, the MC of the REH NL decreased the clonogenic capacity much more than the MC of the SUP-B15 NL (85% vs 25%) of the MSC-WJ pretreated with the two cytokines, confirming that the inhibitory effect of the NL on the self-renewal of MSCs is stronger than that induced by the cytokines. On the other hand, there were no differences between the two leukemic lines in the adipogenic differentiation of MSC pre-treated with cytokines. On the contrary, SUP-B15 did induce greater chondrogenic differentiation than REH. This shows that there is a differential modulation of differentiation by cytokines depending on the mesenchymal lineage involved.
The MC of REH and SUP-B15 induced senescence in MSC on day 3, but without significant differences between them. However, the senescence of MSCs with the REH MC decreased over time, while that of the SUP-B15 MC remained elevated until day 9. The characterization of the secretome showed, in accordance with the above, a higher secretion of pro-inflammatory cytokines by SUP-B15 cells. Interestingly, IL-6, IL-8, and MIF were abundantly secreted (twice as much for IL-6 and IL-8, and four times as much for MIF) in the NL of SUP-B15 compared to the NL of REH. The prolonged exposure of MSCs to IL-6 and IL-8 resulted from day 3 in an increase in senescent cells (SA-β-Gal positive), accompanied by a decrease in proliferation and morphological changes compatible with a senescent process. On days 6 and 9, the cells positive for SA-β-Gal were double those on day 3. No direct activation of NF-κB was evidenced, but the use of a specific NF-κB inhibitor suggested its involvement in the induction of senescence and self-renewal of MSCs.
Finally, the effect of pre-treatment of MSC-SCU with IL-6 and IL-8 on chemoresistance to various drugs was evaluated. No differences were observed between MSC-SCU pre-treated or not with IL-6 and IL-8 for any of the cell lines, nor for the treatments with DOXO and VCR. On the contrary, a differential effect on MTX resistance was evidenced, as pre-treatment with IL-6 and IL-8 significantly reduced the viability of REH (from 70% to less than 50%) and SUP-B15 (from 100% to 80%), showing that the cytokines attenuate the protective effect of MSCs. It is noteworthy that this was true only for MSCs isolated from SCU and not for those isolated from WJ. The REH cells co-cultured with cytokine-pretreated cells and induced to differentiate into adipocytes showed an increase in their viability at both concentrations of MTX used. This effect was not observed in SUP-B15 cells. Chondrogenic differentiation induced a decrease in NL protection in REH cells, but without differences between treatment with or without cytokines. This effect was also observed in SUP-B15, although to a lesser extent. This shows that the effect of differentiation into mesenchymal lineages partly defines the greater or lesser resistance to some chemotherapeutics.
Our results demonstrate that the cytokines IL-6 and IL-8 promote the self-renewal and clonogenicity of MSCs and alter their multipotent differentiation. Moreover, they induce a senescence process and a differential expression of secretome dependent on the aggressiveness of the leukemic subtype. It is also shown that the NL is a highly dynamic microenvironment, and that MSCs exhibit a high reprogramming capacity that can differentially modulate the response of leukemic cells to chemotherapy. This reprogramming of MSCs occurs due to their interaction with leukemic cells and the induction of a secretome rich in pro-inflammatory cytokines such as IL-6 and IL-8, with the concomitant induction of a cellular senescence process, differentiation toward specific lineages, and modulation of chemoresistance. Due to the intrinsic properties of leukemic cells and their interaction with MSCs differing between good (REH) and poor prognosis (SUP-B15) subtypes, this reprogramming will be dissimilar between them, as will chemoresistance. These findings contribute to the understanding of the role of MSCs in B-ALL, particularly due to the dynamics and evolution of MSC functions in the NL, and allow for the conception of strategies to intervene in the stromal support, thereby counteracting chemoresistance and eventually improving the course of the disease.
Descripción
ilustraciones (principalmente a color), diagramas, tablas
Palabras clave propuestas
Leucemiua linfoide aguda de precursores B; Celulas madre mesenquimales; Interleucina 6; Interleucina 8; Nicho leucemico; Senescencia celular; Quimiorresistencia; B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia; Mesenchymal stem cells; Interleukin-6; Interleukin-8; Leukemic niche; Cellular senescence; Chemoresistance
Términos Normalizados
Receptor gp130 de Citocinas; Cytokine Receptor gp130; Receptores de Interleucina-6; Receptors, Interleukin-6; Receptores de Interleucina-8; Receptors, Interleukin-8; Receptores de Citocinas; Receptors, Cytokine; Receptores Inmunológicos; Receptors, Immunologic; 610 - Medicina y salud::616 - Enfermedades; 610 - Medicina y salud::615 - Farmacología y terapéutica