Doctorado en Ciencias Biomédicas

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Modelado computacional de la composición bacteriana intestinal en el contexto de la enfermedad de Parkinson
(Universidad Nacional de Colombia, 2023) Forero Rodriguez, Lady Johanna; Pinzón Velasco, Andrés Mauricio; https://www.researchgate.net/profile/Lady-Forero-Rodriguez; Grupo de Investigación en Bioinformática y Biología de Sistemas
La Enfermedad de Parkinson (EP) es una enfermedad neurodegenerativa de carácter progresivo y crónico, principal causa de pérdida de coordinación de los movimientos (alteraciones motoras) y de alteraciones no motoras, entre las que se incluyen los síntomas gastrointestinales. Clínicamente es definida como la pérdida de neuronas dopaminérgicas en el mesencéfalo. Alteraciones características en la composición de la microbiota intestinal han sido reportadas en pacientes con EP vs controles sanos, sin embargo no se ha caracterizado la composición en pacientes vs controles en latinoamérica y su función aún no es clara en el contexto de esta enfermedad. Para abordar dicha problemática se obtuvo materia fecal de participantes Colombianos (n =25 EP casos idiopáticos, n =25 controles) para el análisis de información de 16S rRNA y su posterior modelado computacional. Los participantes con EP fueron evaluados por un neurólogo experto en desórdenes del movimiento y todos los individuos respondieron a cuestionarios de consumo. Las muestras de heces de estos individuos fueron analizadas a través de la secuenciación del gen 16S rRNA. Se hizo análisis de diversidad, composición diferencial y modelamiento computacional individualizado teniendo en cuenta la dieta y composición bacteriana fecal de cada participante. Nuestros resultados más importantes incluyen lo siguiente: tres metabolitos de la dieta fueron diferentes entre pacientes con PD y controles, tales como Ácidos grasos trans, Carbohidratos y Potasio. Seis zOTUs cambiaron significativamente en sus abundancias relativas entre pacientes con EP ycontroles sanos. Familias Verrucomicrobioaceae, Lachnospiraceae, Peptostreptococcaceae, Lactobacilliaceae, y Streptococcaceae. Además, el modelado metabólico personalizado de los microbiomas intestinales reveló patrones metabólicos que pueden asociarse a la enfermedad, particularmente la particularmente la producción de cinco metabolitos (Ácido fenilacético , Indol , L-triptófano, D-Fructosa y Ácido Mirístico), relacionados al metabolismo de aminoácidos aromáticos y la dieta. Por tanto, los resultados sugieren que la dieta y la composición bacteriana intestinal podrían afectar el metabolismo del huésped y así mismo relacionarse con la enfermedad. (Texto tomado de la fuente).
Identificación de los cambios en los perfiles de metilación de DNA y de expresión génica, asociados a la respuesta clínica al tratamiento quimioterapéutico en pacientes pediátricos con leucemia linfoide aguda tipo B
(Universidad Nacional de Colombia, 2023-03) Torres Llanos, Yulieth Ximena; Combita Rojas, Alba Lucia; Lopez Kleine, Liliana; Yulieth Ximena Torres Llanos; YULIETH XIMENA TORRES LLANOS; 0000-0002-2859-6980; Biología del cáncer. Instituto Nacional de Cancerología
Las leucemias linfoides agudas de células B (LLA-B) son las enfermedades neoplásicas más comunes en niños. Las tasas de supervivencia en la población pediátrica hispana son más bajas en comparación con la supervivencia en niños no hispanos. Por tanto, es necesario encontrar biomarcadores predictivos de respuesta al tratamiento y de pronóstico de recaída y muerte en esta población. El objetivo de este estudio fue identificar biomarcadores de respuesta al tratamiento de inducción, que también pudiesen predecir la recaída y la muerte, a través de la identificación de genes diferencialmente metilados y expresados entre pacientes que respondieron o no a la quimioterapia de inducción. Se extrajeron muestras de DNA y RNA de 46 muestras de médula ósea de niños hispanos recién diagnosticados con LLA-B. Treinta y dos muestras fueron utilizadas como cohorte descriptiva (27 de diagnóstico y 5 post quimioterapia), en la cual se hicieron los análisis de secuencia de RNA y metilación de DNA para elegir los genes candidatos a biomarcadores de respuesta al tratamiento. Por su parte, 18 muestras se utilizaron para validar el set de genes seleccionados del anterior análisis. El mRNA fue secuenciado en el equipo NextSeq500 de Illumina. El DNA fue previamente tratado con bisulfito de sodio y posteriormente se hibridó a los chips de metilación Illumina Infinium EPIC. Los análisis de expresión y metilación diferencial se hicieron a través de la comparación de los perfiles entre respondedores y no respondedores al día 15, al final de la quimioterapia de inducción. Se encontró que DAPK1, CNKSR3, MIR4435-HG2, CTHRC1, NPDC1, SLC45A3, ITGA6 y ASCL2 se sobreexpresaban en los pacientes no respondedores, y también se evidenció que tenían CpGs hipometiladas, dichos hallazgos fueron comunes en todos los grupos analizados. Se hicieron análisis de regresión logística y curvas ROC, se determinó que la sobreexpresión de MIR4435-2HG, DAPK1, ASCL2, SCL45A3, CNKSR3 y NPDC1 puede predecir la falla en la respuesta al día 15 y la refractariedad. Además, con alta sensibilidad y especificidad se evidenció que una mayor expresión de MIR4435-2HG aumenta la probabilidad de falla terapéutica y el riesgo de fallecer. A su vez, se observó que DAPK1, CNKSR3 y MIR4435-2HG también se sobreexpresan en muestras de recaída. Finalmente, la sobreexpresión de MIR4435-2HG en conjunto con la detección de la enfermedad mínima residual positiva se asocian con una menor supervivencia, y la alta expresión de MIR4435-2HG, DAPK1 y ASCL2 mejoran la clasificación de riesgo de los pacientes con cariotipo normal. En conclusión, en este estudio se observó que la expresión de MIR4435-2HG es un potencial biomarcador predictivo y pronóstico en niños hispanos con LLA-B, y su detección en el momento del diagnóstico podría mejorar las tasas de supervivencia en nuestros pacientes. (Texto tomado de la fuente)
Evaluación del potencial angiogénico de medios condicionados obtenidos de células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo cultivadas en un sistema dinámico en la curación de heridas cutáneas
(Universidad Nacional de Colombia, 2022-04) Vargas Carreño, Elga Johanna; Chaparro Garzón, Orlando; Biología de Células Madre
Introducción Las células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo (A-MSC) ejercen su acción regenerativa-reparativa mediante un mecanismo de acción paracrino producido por cientos de factores tróficos, componentes de la matriz extracelular, vesículas extracelulares, etc., que son secretados al medio extracelular. Este secretoma puede recolectarse desde los medios de cultivo como medios condicionados (MC). Los MC de A-MSC poseen un efecto tisular similar al trasplante celular, lo cual permite su uso como alternativa terapéutica. Hasta el momento, los MC de A-MSC son obtenidos esencialmente en cultivos de dos dimensiones (2D) estáticos en normoxia, sin embargo, para escalar su producción es necesario realizar el cultivo en sistemas dinámicos garantizando la conservación de su potencial regenerativo-reparativo. El objetivo principal de este trabajo fue evaluar si al escalar la producción de los MC introduciendo dos cambios en el sistema de cultivo (un sistema tridimensional dinámico e hipoxia) se mantiene la capacidad angiogénica y funcional como una medida indirecta de la conservación de su potencial terapéutico. Materiales y Métodos Se obtuvieron MC de A-MSC de células cultivadas en un sistema 2D estático y un sistema tridimensional (3D) dinámico que emplea spinners flasks acoplados a microtrasportadores, tanto en condiciones de normoxia como de hipoxia. Posteriormente se realizó la cuantificación y la caracterización de su composición proteica y se evaluó su potencial de angiogénesis in vitro y su capacidad funcional mediante un ensayo in vivo de curación de heridas cutáneas agudas en ratas. Resultados Los A-MSC cultivadas en el sistema 3D dinámico conservan su inmunofenotipo y su capacidad de diferenciación multilinaje. Los MC obtenidos de estas A-MSC presentan un perfil proteico único dependiente del donante y modificado por las nuevas variables introducidas al cultivo. Los MC obtenidos en el sistema 3D dinámico conservan su potencial angiogénico y su capacidad funcional demostrado mediante 3 ensayos in vitro de angiogénesis y un modelo in vivo de curación de heridas excisionales agudas en la piel de ratas. Conclusiones Es posible escalar la producción de los MC de A-MSC garantizando la conservación de su potencial angiogénico y su capacidad funcional. La obtención de los MC en condiciones 3D dinámicas en hipoxia puede potenciar su efecto terapéutico en el cierre de heridas cutáneas agudas. (Texto tomado de la fuente).
Papel de la proteína quinasa C (PKC) en el crecimiento de células de leucemia linfoide aguda tipo B, en el soporte que les proporcionan las células stem mesenquimales y en su funcionalidad en un modelo in vitro de nicho leucémico
(Universidad Nacional de Colombia, 2021) Vanegas Avendaño, Natalia-Del Pilar; Vernot, Jean-Paul; Fisiología Celular y Molecular
El microambiente de la médula ósea (MO) impacta de manera importante la progresión de la leucemia, favoreciendo la supervivencia y la resistencia a la muerte celular. Las mesenchymal stem cells (MSC) constituyen una población celular importante del nicho hematopoyético de la MO, sin embargo, su funcionalidad se ve afectada de manera importante por el estrés celular inducido por el crecimiento de las células leucémicas, con consecuencias desfavorables para las células stem hematopoyéticas en favor de las células leucémicas. Se ha demostrado un papel de la proteína quinasa C (PKC) estromal en el soporte, supervivencia y proliferación de varios tipos de leucemia. Las alteraciones de las MSC en la leucemia linfoblástica aguda de células B (LLA-B) solo han sido estudiadas parcialmente. En este trabajo, se mostró que la inhibición específica de la PKC con un péptido quimérico HKPS induce una reducción de la viabilidad, entre un 45 y 60%, de las células leucémicas de pacientes con LLA-B. También, se estudiaron las modificaciones de las MSC en un nicho leucémico in vitro, y en MSC aisladas de pacientes con LLA-B. Las MSC mostraron características de un proceso senescente con pérdida de su morfología fibroblastoide con células aplanadas con aumento de su área citoplasmática, un aumento en la actividad β-galactosidasa asociada a senescencia (SA-βGAL) y en la transcripción de los genes p53 y p21, también la detención del ciclo celular, una reducida clonogenicidad y la generación transitoria de especies reactivas de oxígeno (ROS) citosólico y mitocondrial, siendo las células leucémicas las reguladoras positivas para la inducción de este proceso. En particular, una disfunción moderada en las propiedades stemness, con una proliferación reducida, una pérdida de la capacidad de diferenciación osteoblástica y un aumento de la diferenciación adipogénica y, con un aumento en su capacidad de autorrenovación. Características reportadas en MSC senescentes que, se asocian con la inflamación y, la activación de la vía NF-B encontrada en el modelo in vitro. En este modelo se encontró que, el retiro de las células leucémicas del co-cultivo y el cultivo extendido de las MSC senescentes con un estímulo proliferante (SFB) induce el re-ingreso al ciclo celular y una disminución de la SA-βGAL, sugiriendo una reversión del fenotipo senescente con la reaparición parcial de las propiedades de stem. Además, solo una pequeña población de MSC acumuló daño al DNA por la fosforilación de H2AX que además se redujo a niveles basales después del cultivo. También se encontró un perfil claro de citoquinas y quimioquinas pro-inflamatorias (CCL2, IL-8, IL-6), característico de un fenotipo secretor asociado a la senescencia (SASP) en el NL, que fundamenta las acciones de las MSC en el microambiente leucémico a través de mecanismos paracrinos y el cual fue mediado por la actividad de la PKC. En conclusión, la afectación que sufren las MSC requiere de la presencia permanente de células leucémicas, y cuando se retira el estrés leucémico, las MSC retoman prácticamente a su funcionamiento normal. Estos hallazgos son de gran relevancia en la progresión de la enfermedad y en el tratamiento.(Texto tomado de la fuente)
Estudio celular de la inmunosenescencia en adultos mayores vacunados y en pacientes con cáncer de mama
(Universidad Nacional de Colombia, 2021-06-02) Rodríguez Rodríguez, Ivon Johanna; Parra López, Carlos Alberto
Introducción: La mejora continua de las condiciones de saneamiento básico ha aumentado la esperanza de vida de la población en la mayoría de los países, lo que se traduce en una mayor prevalencia de las enfermedades crónicas no transmisibles. El envejecimiento es un proceso heterogéneo de salud-enfermedad caracterizado por el deterioro progresivo de la capacidad funcional de las células que componen el organismo, incluidas las que componen el sistema inmune. Este deterioro de las células compromete la capacidad proliferativa, promueve la detención del ciclo celular, la expresión de marcadores asociados con la senescencia y el agotamiento, la producción de citocinas pro y antiinflamatorias y la acumulación de células senescentes. Además, el envejecimiento del sistema inmune (inmunosenesencia) se ha asociado con una menor capacidad de respuesta a la vacunación (parcialmente explicado por cambios en la frecuencia y fenotipo de los LT CD4+ foliculares helper (LTfh)) y una mayor susceptibilidad al cáncer, causado por inmunovigilancia deficiente del tumor. Materiales y Métodos: Para identificar el perfil de inmunosenescencia y su relación con una respuesta inmune deficiente a la vacunación y una mayor susceptibilidad al desarrollo de enfermedades como el cáncer, se analizó mediante citometría de flujo multiparamétrica el perfil fenotípico y funcional de diferentes subpoblaciones de leucocitos en sangre periférica de tres grupos de voluntarios: (i) adultos mayores sanos, (ii) adultos mayores sanos vacunados con toxoide tetánico y (iii) mujeres con cáncer de mama antes y después de la quimioterapia. Los datos recolectados se analizaron manualmente utilizando el software de análisis FlowJo y mediante algoritmos automatizados de reducción de dimensionalidad (t-SNE) y agrupamiento no supervisado (FlowSOM y CITRUS). Este protocolo fue aprobado por el comité de ética de la facultad de medicina de la Universidad Nacional de Colombia No. 008-063. .. Resultados: (i) Los adultos sanos exhiben un incremento de monocitos proinflamatorios con una disminución en la respuesta al estímulo inflamatorio, y un número mayor de poblaciones senescentes de células asesinas naturales y linfocitos T, (ii) Los adultos mayores tienen una menor expansión de LTfhc después de la vacunación contra toxoide tetánico que los jóvenes, y una menor expresión de Bcl-6, CXCR3 y CD40L, moléculas importantes para la diferenciación de LTfhc y su interacción en los centros germinales con linfocitos B y (iii) las pacientes con cáncer de mama prequimioterapia exhiben cambios en la frecuencia y el fenotipo de diferentes poblaciones de leucocitos con características de inmunosenescencia y agotamiento celular, que pueden estar afectando su capacidad de inmunovigilancia. Después de la quimioterapia neoadyuvante hay cambios asociados con inmunomodulación, pero también un incremento en marcadores de senescencia. Conclusiones: Encontramos cambios asociados con la inmunosenescencia que podrían aumentar la susceptibilidad de los adultos mayores a enfermedades crónicas no transmisibles, infecciones y cáncer, una menor capacidad de expansión de Tfh en adultos mayores como lo demuestra la respuesta de vacunación al toxoide tetánico. Y en pacientes con cáncer de mama, las características de inmunosenescencia de los leucocitos pueden estar asociadas con un mecanismo de escape del tumor. Además, la quimioterapia podría tener un papel ambiguo sobre los leucocitos, por un lado, generando cambios funcionales para favorecer la reactivación de la inmunovigilancia y, por otro, aumentando la senescencia en las células asesinas naturales y los Linfocitos T. (Texto tomado de la fuente)
Virulencia, respuesta inmune in vivo y transcriptómica de Mycobacterium tuberculosis genotipo Beijing circulante en Colombia
(Universidad Nacional de Colombia, 2021-07-27) Cerezo Cortés, María Irene; Murcia Aranguren, Martha Isabel; Hernández Pando, Rogelio Enrique; MICOBAC-UN; Rodríguez Juan Germán
La tuberculosis (TB) continúa siendo un grave problema de salud pública mundial. En Colombia, el linaje mas prevalente es el Euroamericano. El aumento de la circulación del genotipo Beijing en el territorio nacional, el cual se asocia con resistencia a medicamentos e hipervirulencia causando la muerte de los pacientes, es motivo de investigación. La variante Beijing-Like SIT190 es la más prevalente en Colombia, seguido del Beijing-Clásico SIT1. Los mecanismos patogénicos y modulatorios son desconocidos. El presente trabajo comparó el comportamiento de las cepas 323 (Beijing-Like) y 391 (Beijing-Clásico), en un modelo de TB pulmonar en ratones Balb/c. El curso de la enfermedad fue diferente para cada grupo de animales, los infectados con Beijing-Like tuvieron una mortalidad del 100% al día 45 post-infección (PI), con altas cargas bacilares y neumonía masiva, mientras que el total de los infectados con Beijing-Clásico murieron hacia el día 60 PI por neumonía y necrosis. Se realizó RNA-seq dual para determinar el perfil de expresión génica a los días 3, 14, 28 y 60 PI. En los ratones infectados con Beijing-Clásico se sobreexpresaron genes asociados con respuesta proinflamatoria, comparado con los infectados con Beijing-Like que sobreexpresaron genes asociados con respuesta antiinflamatoria; siendo ambas cepas inductoras de respuesta inmune no protectora. El genotipo Beijing-Like causó enfermedad aguda y fulminante y, Beijing-Clásico causó TB crónica pero severa. A nivel bacteriano, con el RNA-seq de Mtb se logró ~33% del transcriptoma completo a los días 3, 14, 28 y 60 PI. El perfil de expresión fue diferente para 323 Beijing-Like y para 391 Beijing Clásico, evidenciando que las variaciones a nivel regulatorio desencadenan un fenotipo diferente en el hospedador. (Texto tomado de la fuente)
Transición Epitelio-Mesenquimal y funciones stem: Papel de la IL-8 en la funcionalidad de las células de la línea celular de cáncer de seno MCF-7 en condiciones de resistencia a la anoikis
(2020-11-04) Ospina Muñoz, Natalia; Vernot Hernandez, Jean Paul; Fisiología Celular y Molecular
La Interleuquina 8 (IL-8) es un importante regulador del microambiente tumoral (MAT), promoviendo la transición epitelio mesenquimal (EMT) y la adquisición de propiedades de células stem por parte de las células tumorales (CSC). El ensayo de formación de mamoesferas se ha utilizado para la identificación y enriquecimiento de las CSC. La IL-8 induce la formación de mamoesferas más grandes, lo que sugiere el enriquecimiento de CSC. En el presente trabajo nuestro objetivo fue estudiar las características fenotípicas y funcionales de las células presentes en las mamoesferas de las células MCF-7 previamente tratadas con IL-8. Las células MCF-7 adheridas fueron tratadas con IL-8 durante 5 días y luego fueron cultivadas por 5 días más en condiciones no adherentes (resistencia a la anoikis). Demostramos que la presencia de mamoesferas con mayor tamaño en la condición IL-8, no fue consecuencia de una mayor proliferación mediada por esta citoquina. Se encontró que a pesar del mantenimiento del fenotipo EMT con presencia de células híbridas que expresaban tanto E-cadherina como SNAI2, las propiedades esenciales de células stem se vieron afectadas en las mamoesferas tratadas con IL-8. La capacidad de autorrenovación se incrementó en las células tratadas con IL-8 solo en la primera generación de mamoesferas, pero este incremento no se sostuvo en ensayos consecutivos. En consecuencia, la autorrenovación, la reprogramación, la capacidad de diferenciación a adipocitos y la clonogenicidad también se vieron afectadas. También, mostramos que las mamoesferas estaban enriquecidas en células luminales diferenciadas (EpCAM+/CD49f-). Además, las células MCF-7 aisladas de mamoesferas derivadas de IL-8 también presentaron una mayor migración e invasión dirigida por IL-8. Adicionalmente, las células dentro de las mamoesferas derivadas del tratamiento con IL-8 fueron altamente resistentes al Paclitaxel (PLX) y la Doxorrubicina (DOX). Por lo tanto, mostramos aquí que la línea de cáncer de seno no agresiva MCF-7, a pesar de un índice bajo de funciones stem, podría adquirir selectivamente atributos particulares de células stem muy relevantes para la progresión del cáncer.
Evaluación de miRNAs en la línea celular de melanoma B16 inducida a pigmentación diferencial y disminución del crecimiento celular por la L-Tirosina y la 5-bromo-2´-deoxiuridina
(2020-12-04) Rivera Escobar, Hernán Mauricio; Gómez Grosso, Luis Alberto; Fisiología Celular y Molecular
miRNAs are small non-coding RNAs associated with post-transcriptional gene regulation in melanoma, a cancer of melanocytes, cells specialized in melanin synthesis. The present work aimed to evaluate the differential expression of miRNAs and to establish potential functional relationships through their targets in the B16F1 melanoma cell line under conditions of decreased cell growth and differential pigmentation induced by L-tyrosine (L-Tyr) and 5-Bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) in vitro. A reduction in proliferation and changes in melanin concentration was confirmed in B16F1 cells exposed to 2.5 µg. mL-1 BrdU or 5 mM L-Tyr. Using DEseq2, counts obtained by small RNAseq were analyzed and differential expression of 35 miRNAs in cells exposed to L-Tyr, 22 under-expressed, and 14 over-expressed; and of 33 miRNAs by exposure to BrdU, 11 over-expressed and 21 under-expressed. The bioinformatics analysis facilitated the construction of co-expression and miRNA regulation network models together with associated targets by KEGG functional enrichment, with the control of the cell cycle, senescence, and pigmentation. Expression levels of 211-5p, 129-5p, 148b-3p, 470-5p, 470-3p, 27b-3p and 30d-5p microRNAs and Mitf, Tyr, Tyrp1, Dct, Ccnd1, Cdk4 Cdk2 and p21 mRNAs were confirmed by RT-qPCR. The results obtained, improve our understanding of the potential functional associations between miRNAs and gene sets during melanogenesis, cell cycle control, and senescence and propose new scenarios for the study of melanoma.
Desarrollo de prototipos de soportes tridimensionales a base de colágeno tipo I E Hidroxiapatita para regeneración ósea
(2020-02-27) Moncayo Donoso, Miguelangel
El hueso es uno de los tejidos de mayor demanda para trasplante a nivel mundial, representando cerca de 2,2 millones de injertos anualmente. Por medio de la ingeniería de tejidos ósea (BTE) se han desarrollado estrategias que permiten la regeneración del tejido, sin embargo, el desarrollo de un sustituto óseo que tenga las características estructurales y funcionales del hueso nativo sigue siendo un desafío. En este trabajo se propuso el desarrollo de prototipos de soportes bioinspirados en la composición y en la microestructura del hueso. Estos soportes se caracterizaron microestructural, mecánica, biológica y fisicoquímicamente, y su potencial osteoconductivo se probó in vitro mediante la siembra y diferenciación de células madre mesenquimales asiladas de médula ósea de rata (rBM-MSC) y células madre mesenquimales humanas asiladas de gelatina de Wharton (hWJ-MSC), e in vivo mediante un modelo ectópico intramuscular en rata. Los soportes desarrollados (UC: colágeno unidireccional; MC: colágeno multidireccional; UCH: colágeno/hidroxiapatita unidireccional y MCH: colágeno/hidroxiapatita multidireccional) presentaron una microestructura porosa interconectada con una porosidad 90% y poros 300 µm. Mecánicamente los soportes unidireccionales (UC y UCH) fueron más resistentes y elásticos en comparación con los multidireccionales (MC y MCH). In vitro, las MSC proliferan y se diferencian a un linaje osteoblástico en presencia de factores osteogénicos. In vivo, se observó la formación ectópica de hueso orientado axialmente en soportes unidireccionales. Cuantitativamente la cantidad de hueso formado fue mayor en soportes unidireccionales en combinación con los factores BMP-2+VEGF. Los soportes unidireccionales desarrollados en este trabajo podrían representar una nueva alternativa en la BTE para la regeneración de tejido óseo con propiedades microestructurales y funcionales similares a las del hueso cortical nativo.
Efecto de agonistas PPARs E IGF1 en modelos In Vitro de Leucodistrofias
(2019-09-03) Jaramillo Gómez, Jenny Andrea
RESUMEN: Los oligodendrocitos son células gliales altamente especializadas del sistema nervioso central (SNC) encargadas de la formación de la mielina, la cual envuelve los axones de las neuronas y contribuye a la eficiencia y rapidez de la transmisión saltatoria de los potenciales de acción. La pérdida de la mielina resulta en la disminución de la velocidad del impulso nervioso con dispersión temporal, inhabilidad para sostener los trenes de los impulsos nerviosos y bloqueo de la conducción, lo cual puede relacionarse con varios desórdenes neurológicos, como las leucodistrofias, por ejemplo, la adrenoleucodistrofia ligada al cromosoma X (ALD-X) y la enfermedad de Krabbe (EK). Aunque, se ha avanzado en el entendimiento de la fisiopatología de este tipo de desórdenes, en la actualidad muchos aspectos son poco entendidos y faltan por conocer varios procesos relacionados con la biología básica de los oligodendrocitos, que de ser dilucidados contribuirían de manera positiva a la búsqueda de posibles blancos terapéuticos. Con base en lo anterior, en este trabajo se establecieron modelos in vitro para la ALD-X y la EK, con el propósito de estudiar el posible efecto de agonistas de receptores activados por el proliferador peroxisomal (PPARs, del inglés, peroxisome proliferator-activated receptors) y el factor de crecimiento similar a la insulina tipo 1 (IGF1, del inglés insulin-like growth factor 1) sobre las vías de señalización relacionadas con proliferación, supervivencia, metabolismo y diferenciación celular. Los PPARs son receptores nucleares conformados por al menos tres tipos: PPARα, PPARβ y PPARγ. Los PPARs regulan la expresión génica a través del reconocimiento y unión a los denominados elementos reguladores de respuesta a PPAR (PPREs, del inglés PPARs response elements) presentes en la región promotora de los genes blanco, los cuales se encargan de regular la expresión de genes implicados en el metabolismo de lípidos, aumentar la sensibilidad a la insulina, y mitigar la inflamación en patologías neurológicas y algunos tipos de cáncer, entre otros. Mientras tanto, el IGF1 tiene efecto en la transducción de vías de señalización dependientes de receptores tirosina cinasa, tales como las vías PI3K/AKT, MAPK/ERK1-2 y AMPK/mTOR. ADRENOLEUCODISTROFIA LIGADA AL CROMOSOMA X: La ALD-X se caracteriza por la acumulación de ácidos grasos de cadena muy larga (VLCFA, del inglés very large chain fatty acids), como consecuencia de mutaciones en el gen ABCD1 que conducen a la deficiencia de la proteína de la adrenoleucodistrofia (ALDP o Abcd1), encargada del transporte de los VLCFA hacia el interior de los peroxisomas para su β-oxidación. En este estudio se logró trabajar con los modelos in vitro de ALD-X por RNA de interferencia del gen ABCD1 en las líneas oligodendrogliales MO3.13 y B12, y con oligodendrocitos diferenciados obtenidos a partir de células madre pluripotentes inducibles (iPSCs, del inglés, induced Pluripotent Stem Cells) derivadas de pacientes con ALD-X infantil (cALD, del inglés, childhood adrenoleukodystrophy) y adrenomieloneuropatía (AMN). El análisis por western demostró que las células shABCD1 y los oligodendrocitos derivados de pacientes presentaban menor expresión de la proteína ALDP, lo cual se relacionó con mayor susceptibilidad a la muerte durante el proceso de diferenciación in vitro, disminución de la expresión de marcadores de maduración oligodendroglial, como la proteína básica de mielina (MBP) y CNPase. Adicionalmente, se encontró que las células deficientes de ALDP presentaron mayores niveles en la fosforilación de AKT (Ser 473) y disminución en la fosforilación de AMPKα/β (Thr 172 / Ser 108). Y solo el tratamiento con IGF1 por 24 horas y 4 días fue capaz de proteger de la muerte a las células MO3.13 shABCD1 durante el periodo de diferenciación. Adicionalmente, en los oligodendrocitos diferenciados obtenidos de iPSCs de pacientes con ALD-X se encontró pérdida del potencial de membrana mitocondrial y disminución de la intensidad de fluorescencia de los marcadores peroxisomales PMP70 y PEX14, así como disminución en la acetilación de la histona 3 y de residuos de lisinas. Finalmente, se concluyó que las vías PI3K/AKT y AMPK/mTOR están alteradas en los modelos de oligodendrocitos ALD-X analizados en este estudio, y que la alteración de estas vías podría ser el reflejo de la disfunción peroxisomal y mitocondrial que ocurre en los oligodendrocitos deficientes de ALDP, por tanto se sugiere que la activación de las vías PI3K/AKT y AMPK/mTOR podría actuar como un mecanismo neuroprotector para compensar la disfunción metabólica que ocurre en las células precursoras de oligodendrocitos (OPCs) y en los oligodendrocitos en el contexto neurotóxico de acumulación de ácidos grasos de cadena muy larga. ENFERMEDAD DE KRABBE: La EK es un desorden neurodegenerativo fatal, causado por mutaciones en el gen GALC, el cual codifica para la enzima lisosomal galactocerebrosidasa, GalC, estas mutaciones conducen a la disfunción de la enzima y a la acumulación de galactosilesfingosina (Psicosina), esfingolípido altamente nerotóxico, que genera muerte de oligodendrocitos y neuronas. En este trabajo se estudiaron los mecanismos moleculares involucrados en la muerte de oligodendrocitos por acumulación de Psicosina y el efecto neuroprotector del IGF1 y agonistas PPARs (Rosiglitazona, GW0742 y WY14643). En las células MO3.13, se desarrollaron dos modelos distintos de EK, uno exógeno por adición de Psicosina (10µM por 24 horas) y otro endógeno mediante el silenciamiento del gen GALC, usando un vector inducible con tetraciclina. Adicionalmente, los resultados obtenidos en las células MO3.13 se validaron en cultivos primarios de oligodendrocitos derivados de cerebros de ratones un día postnatal. Los resultados de esta investigación demuestran que la Psicosina impacta la vía de supervivencia PI3K/AKT por disminución de los niveles de fosforilación del receptor IGF1β (Tyr 1161) y AKT (Ser 473) y sugieren que la muerte celular producida por Psicosina puede ser atenuada por los pretratamientos de IGF1 y Rosiglitazona (agonista PPAR-γ). Asimismo, las células shGALC inducidas con tetraciclina no responden al tratamiento de IGF1 por una hora. Por otra parte, los tratamientos con IGF1 y Rosiglitazona aumentaron el número de peroxisomas y mitocondrias por célula, pero estos pretratamientos no lograron proteger a las células de la disminución del número de mitocondrias como efecto de la Psicosina. En conclusión, el tratamiento con Psicosina exógena o el silenciamiento del gen GALC para inducir acumulación de Psicosina endógena causó muerte celular, pérdida del número de mitocondrias por célula e inhibición de la vía PI3K/AKT y los pretratamientos con IGF1 y Rosiglitazona tienen un efecto neuroprotector en oligodendrocitos en el contexto de EK.
Efecto de las citoquinas IL6 e IL8 en la inducción de la transición epitelio-mesenquimal y de CD44 en el desarrollo de funciones stem en células epiteliales tumorales
(2018-05-22) Ortiz Montero, Paola
La transición epitelio-mesenquimal (EMT) es un programa celular que ocurre durante la homeostasis de los tejidos, y en condiciones patológicas como el cáncer. En células pre- malignas o malignas, la EMT conlleva a la adquisición de propiedades migratorias e invasivas, y a un fenotipo con funciones de célula stem (o stem-like)1, que se ha asociado con un mayor potencial tumorigénico. Estas células se denominaron como células stem cancerígenas (CSC2), y se han identificado en diversos tipos de cáncer por la expresión de marcadores específicos (CD44, CD133, CD105, ALDH, EpCAM) o por pruebas funcionales. Por otra parte, se sabe que la senescencia celular es un mecanismo de supresión tumoral. Sin embargo, las células tumorales evaden este mecanismo de diferentes maneras y pueden utilizarlo para su crecimiento. En un modelo de células embrionarias de riñón humano (HEK) inmortalizadas, se mostró que estas células eran tumorigénicas únicamente en presencia de fibroblastos senescentes. Se encontró que las células recuperadas o explantadas de estos tumores mostraron un incremento en las propiedades de células stem, esto es capacidad de autorrenovación y de diferenciación multipotente y, sorprendentemente, capacidad autónoma para formar tumores. Igualmente, un medio condicionado de fibroblastos senescentes (MeCoSe) indujo en estas células plasticidad epitelial (fenotipo híbrido con marcadores epiteliales y mesenquimales, con expresión elevada de CD44 y variable de CD24) y adquisición de propiedades de células stem, sugiriendo que los factores solubles serían responsables de estas adquisiciones funcionales. La caracterización del MeCoSe mostró que estaba enriquecido principalmente en las citoquinas pro-inflamatorias IL6 e IL8. En la línea celular MCF-7 de cáncer de seno tipo luminal, clasificada como poco agresiva, mostramos que IL6 e IL8 indujeron la EMT, funciones de células stem (autorrenovación y capacidad de diferenciación multipotente) y una mayor migración e invasión, es decir, células con un fenotipo mucho más agresivo. De esta manera, se mostró que células no tan agresivas o pre- malignas pueden adquirir un fenotipo más tumorigénico cuando se encuentran en un microambiente senescente. La utilización de anticuerpos neutralizantes para IL6 e IL8 y la 1 Stem-like para denotar células que presentan un fenotipo y funciones similares a la de células madre normales o referidas aquí como stem. 2 Células denominadas también como células stem tumorales, o células iniciadoras de tumor (TIC, por sus siglas en inglés) y referidas aquí como CSC. Son células que además de presentar características de células stem, presentan una alta capacidad de formar tumores. 15 activación de la vía de señalización de Jak/Stat3 confirmaron la relevancia de estas citoquinas en estos procesos. La población de células enriquecidas en el marcador CD44 mostró una mayor adhesión y migración, pero no una mayor capacidad de autorrenovación. Por otra parte, mostramos una relación importante entre la senescencia y la inflamación, y de manera muy relevante, que existen mecanismos celulares de retroalimentación recíproca, con células senescentes que producen citoquinas inflamatorias, las cuales a su vez inducen más senescencia y secreción adicional de citoquinas inflamatorias que perpetúan el estímulo y la aparición de CSC. Se evaluó también el papel de IL6 e IL8 en una línea celular del subtipo basal/mesenquimal, claudina bajo (MDA-MB-231), con fenotipo EMT y por ende propiedades stem, que secreta IL6 e IL8 de manera constitutiva y además, es más agresiva. La neutralización de las citoquinas disminuyó la capacidad de migración de células MDA- MB-231, pero no tuvo un efecto mayor sobre sus propiedades stem. No obstante, estas células presentaron funciones de células stem incompletas, es decir, una menor capacidad de autorrenovación y una diferenciación multipotente anormal. Estos experimentos muestran que un fenotipo tumoral puede ser modulado mayormente por el microambiente tumoral y sugieren que si bien la capacidad tumorigénica se asocia de manera general con propiedades de células stem, esta puede darse en contexto de unas funciones stem no tan robustas, siempre y cuando el contexto celular (presencia de ciertas capacidades funcionales) las complemente de manera adecuada. Para evaluar mejor la relación entre tumorigenicidad y la presencia o adquisición de funciones de células stem, se utilizó nuevamente el modelo de células HEK explantadas. La selección de dos subpoblaciones de la línea celular explantada PC1-Expl-1, con base en la expresión del marcador CD24, mostró que a pesar de que las células CD44+CD24Pos presentaron un fenotipo EMT, una mayor migración e invasión, y un enriquecimiento en propiedades de células stem, fueron incapaces de formar tumores. Por el contrario, las células CD44+CD24Neg formaron tumores de manera muy eficiente, muy similar a las células parentales (PC1-Expl-1). Al igual que lo que señalamos arriba para la línea de cáncer de seno MDA-MB-231, las células CD44+CD24Neg mostraron funciones de células stem menos robustas, pero mayor capacidad de adhesión, de proliferación celular y de formación de colonias, revelando que otras características funcionales adicionales pueden ser determinantes en el potencial tumorigénico y que éstas dependerían de las funciones de células stem que presenten las células malignas en un momento determinado del desarrollo 16 tumoral. En otras palabras, los resultados obtenidos en estos modelos sugieren que un estado stem (en inglés, stemness3) completo no es indispensable para la tumorigenicidad, y que la agresividad tumoral puede deberse a otras características celulares que complementan las funciones de células stem presentes en la célula tumoral. Si la tumorigenicidad resulta ser dependiente de ciertas características de células stem que se manifiestan en conjunto en un contexto celular particular y en una etapa determinada del desarrollo tumoral, su definición sería de relevancia para el desarrollo de nuevos blancos terapéuticos.
Senescencia e inflamación en cáncer: Efecto de las citoquinas IL6 e IL8 en la inducción de la transición epitelio-mesenquimal y de CD44 en el desarrollo de funciones stem en células epiteliales tumorales
(2018-05-22) Ortiz Montero, Paola
La transición epitelio-mesenquimal (EMT) es un programa celular que ocurre durante la homeostasis de los tejidos, y en condiciones patológicas como el cáncer. En células pre- malignas o malignas, la EMT conlleva a la adquisición de propiedades migratorias e invasivas, y a un fenotipo con funciones de célula stem (o stem-like)1, que se ha asociado con un mayor potencial tumorigénico. Estas células se denominaron como células stem cancerígenas (CSC2), y se han identificado en diversos tipos de cáncer por la expresión de marcadores específicos (CD44, CD133, CD105, ALDH, EpCAM) o por pruebas funcionales. Por otra parte, se sabe que la senescencia celular es un mecanismo de supresión tumoral. Sin embargo, las células tumorales evaden este mecanismo de diferentes maneras y pueden utilizarlo para su crecimiento. En un modelo de células embrionarias de riñón humano (HEK) inmortalizadas, se mostró que estas células eran tumorigénicas únicamente en presencia de fibroblastos senescentes. Se encontró que las células recuperadas o explantadas de estos tumores mostraron un incremento en las propiedades de células stem, esto es capacidad de autorrenovación y de diferenciación multipotente y, sorprendentemente, capacidad autónoma para formar tumores. Igualmente, un medio condicionado de fibroblastos senescentes (MeCoSe) indujo en estas células plasticidad epitelial (fenotipo híbrido con marcadores epiteliales y mesenquimales, con expresión elevada de CD44 y variable de CD24) y adquisición de propiedades de células stem, sugiriendo que los factores solubles serían responsables de estas adquisiciones funcionales. La caracterización del MeCoSe mostró que estaba enriquecido principalmente en las citoquinas pro-inflamatorias IL6 e IL8. En la línea celular MCF-7 de cáncer de seno tipo luminal, clasificada como poco agresiva, mostramos que IL6 e IL8 indujeron la EMT, funciones de células stem (autorrenovación y capacidad de diferenciación multipotente) y una mayor migración e invasión, es decir, células con un fenotipo mucho más agresivo. De esta manera, se mostró que células no tan agresivas o pre- malignas pueden adquirir un fenotipo más tumorigénico cuando se encuentran en un microambiente senescente. La utilización de anticuerpos neutralizantes para IL6 e IL8 y la 1 Stem-like para denotar células que presentan un fenotipo y funciones similares a la de células madre normales o referidas aquí como stem. 2 Células denominadas también como células stem tumorales, o células iniciadoras de tumor (TIC, por sus siglas en inglés) y referidas aquí como CSC. Son células que además de presentar características de células stem, presentan una alta capacidad de formar tumores. 15 activación de la vía de señalización de Jak/Stat3 confirmaron la relevancia de estas citoquinas en estos procesos. La población de células enriquecidas en el marcador CD44 mostró una mayor adhesión y migración, pero no una mayor capacidad de autorrenovación. Por otra parte, mostramos una relación importante entre la senescencia y la inflamación, y de manera muy relevante, que existen mecanismos celulares de retroalimentación recíproca, con células senescentes que producen citoquinas inflamatorias, las cuales a su vez inducen más senescencia y secreción adicional de citoquinas inflamatorias que perpetúan el estímulo y la aparición de CSC. Se evaluó también el papel de IL6 e IL8 en una línea celular del subtipo basal/mesenquimal, claudina bajo (MDA-MB-231), con fenotipo EMT y por ende propiedades stem, que secreta IL6 e IL8 de manera constitutiva y además, es más agresiva. La neutralización de las citoquinas disminuyó la capacidad de migración de células MDA- MB-231, pero no tuvo un efecto mayor sobre sus propiedades stem. No obstante, estas células presentaron funciones de células stem incompletas, es decir, una menor capacidad de autorrenovación y una diferenciación multipotente anormal. Estos experimentos muestran que un fenotipo tumoral puede ser modulado mayormente por el microambiente tumoral y sugieren que si bien la capacidad tumorigénica se asocia de manera general con propiedades de células stem, esta puede darse en contexto de unas funciones stem no tan robustas, siempre y cuando el contexto celular (presencia de ciertas capacidades funcionales) las complemente de manera adecuada. Para evaluar mejor la relación entre tumorigenicidad y la presencia o adquisición de funciones de células stem, se utilizó nuevamente el modelo de células HEK explantadas. La selección de dos subpoblaciones de la línea celular explantada PC1-Expl-1, con base en la expresión del marcador CD24, mostró que a pesar de que las células CD44+CD24Pos presentaron un fenotipo EMT, una mayor migración e invasión, y un enriquecimiento en propiedades de células stem, fueron incapaces de formar tumores. Por el contrario, las células CD44+CD24Neg formaron tumores de manera muy eficiente, muy similar a las células parentales (PC1-Expl-1). Al igual que lo que señalamos arriba para la línea de cáncer de seno MDA-MB-231, las células CD44+CD24Neg mostraron funciones de células stem menos robustas, pero mayor capacidad de adhesión, de proliferación celular y de formación de colonias, revelando que otras características funcionales adicionales pueden ser determinantes en el potencial tumorigénico y que éstas dependerían de las funciones de células stem que presenten las células malignas en un momento determinado del desarrollo 16 tumoral. En otras palabras, los resultados obtenidos en estos modelos sugieren que un estado stem (en inglés, stemness3) completo no es indispensable para la tumorigenicidad, y que la agresividad tumoral puede deberse a otras características celulares que complementan las funciones de células stem presentes en la célula tumoral. Si la tumorigenicidad resulta ser dependiente de ciertas características de células stem que se manifiestan en conjunto en un contexto celular particular y en una etapa determinada del desarrollo tumoral, su definición sería de relevancia para el desarrollo de nuevos blancos terapéuticos.
Efectos de la inhibición de las desacetilasas de histonas sobre los cambios inducidos por el estrés agudo en la memoria espacial, los niveles de corticosterona, la acetilación de histonas y la expresión de GR y HDAC2
(2017) Vargas López, Derly Viviana
La inducción de estrés agudo previo al entrenamiento de una tarea de aprendizaje espacial deteriora la formación de la memoria a largo plazo. Se han descrito algunos de los mecanismos celulares y moleculares asociados a este efecto en cerebros de roedores, pero se desconocen sus mecanismos epigenéticos. Dado que el entrenamiento en tareas espaciales y el estrés intenso tienen efectos opuestos en el nivel de acetilación de las histonas, es concebible que los efectos deletéreos del estrés sobre la memoria estén mediados por la alteración de su balance. Bajo estos supuestos, se hipotetizó que la inhibición farmacológica de las desacetilasas de histonas evitaría los efectos deletéreos del estrés sobre la memoria. En el presente estudio se evaluó la efectividad de la inhibición de las desacetilasas de tipo I y II con Tricostatina-A para prevenir los efectos a largo plazo del estrés agudo por restricción de movimientos sobre la consolidación de la memoria espacial, los niveles de corticosterona en plasma y cambios en la acetilación de histonas y la expresión del receptor de glucocorticoides (GR/Nr3c1), la desacetilasa de histonas 2 (HDAC2/Hdac2) y subunidades del receptor NMDA (Grin1, Grin2a y Grin2b) en la corteza prefrontal, el hipocampo y la amígdala de ratas Wistar macho adultas. Se encontró que la inhibición de las HDACs evitó que el estrés agudo deteriorara la consolidación de la memoria espacial y potenciara el incremento en los niveles de corticosterona después de la prueba de memoria a largo plazo; además, la inhibición de las HDACs evitó que el estrés indujera cambios en los niveles de acetilación de histonas y en la expresión de GR y HDAC2 en la corteza, el hipocampo o la amígdala de animales entrenados y no entrenados en la tarea espacial. Sin embargo, la inhibición de las HDACs no evitó que estrés agudo alterara la expresión de sub-unidades del receptor NMDA, con excepción de los cambios inducidos en Grin2b en la corteza prefrontal de animales entrenados en la tarea espacial. Estos resultados sustentan la hipótesis de que el deterioro en la consolidación de la memoria espacial causado por estrés agudo supone la alteración del balance de acetilación de histonas, y sugieren que este mecanismo epigenético también tiene un papel en la regulación de la respuesta de estrés y la expresión de GR y HDAC2 en regiones del cerebro que participan en la consolidación de la memoria.
Evaluación de la capacidad inmuno-estimulante de la terapia neo-adyuvante con Doxorrubicina y Ciclofosfamida en pacientes con cáncer de mama
(2017-11) Bernal Estévez, David Andrés
La evidencia experimental en modelos de cáncer en animales y estudios clínicos en pacientes con cáncer, sugieren que ciertos regímenes de quimioterapia o radioterapia estimulan el sistema inmune. La Doxorrubicina es un agente quimioterapéutico ampliamente estudiado por su capacidad de inducir muerte celular inmunogénica en células tumorales, un tipo de muerte celular que probablemente favorece la presentación cruzada de antígenos tumorales por células dendríticas (DCs) necesaria para la inmunidad anti tumoral mediada por linfocitos T (LT)-CD8+. Por otra parte, varios informes indican que la Ciclofosfamida utilizada a bajas dosis en pacientes con cáncer reduce el número de LT-CD4+ supresores FoxP3+ (Tregs). A pesar de que el tratamiento con Doxorrubicina y Ciclofosfamida (esquema de quimioterapia A/C) se utiliza ampliamente en nuestro país para el tratamiento neo-adyuvante de pacientes con cáncer de mama, el efecto inmuno-estimulante del tratamiento con A/C en estas pacientes está pendiente de ser demostrado. En un esfuerzo por revelar el efecto inmuno-estimulante de la terapia antitumoral, en esta tesis se implementó un sistema de inmuno-monitoreo de leucocitos de sangre de pacientes con cáncer de mama, que permite establecer correlación entre la respuesta clínica de las pacientes a la quimioterapia con algunos fenotipos funcionales de respuesta inmune celular evaluados in vitro. Para establecer este sistema de inmuno-monitoreo fue necesario optimizar en primer lugar, condiciones in vitro que permitiesen cotejar en sangre periférica de una paciente antes y después de la terapia antitumoral distintas funciones en LT (CD4+ y CD8+) específicos de antígenos tumorales, los cuales se encuentran habitualmente en muy bajo número en sangre de pacientes con cáncer. La etapa de implementación estuvo seguida de la validación de la utilidad del monitoreo de estas funciones celulares en células de un grupo de pacientes con cáncer de mama obtenidas antes y después de tres ciclos de quimioterapia neo-adyuvante con A/C con la capacidad de la terapia antitumoral de restablecer algunas funciones de la respuesta inmune celular. El inmuno-monitoreo de las células de las pacientes con cáncer de mama se realizó en gran medida por el análisis manual de datos de citometría de flujo (CF) multi-paramétrica que permite cuantificar múltiples parámetros y fenotipos celulares en las poblaciones celulares analizadas. Sin embargo, la disponibilidad reciente de nuevos algoritmos bio-informáticos como SPADE, FLOCK, tSNE, y más recientemente CITRUS, que proporcionan nuevas herramientas visuales y estadísticas para el análisis automatizado multidimensional de datos obtenidos por CF los cuales han sido empleados hasta ahora para el análisis jerárquico de la diferenciación de células derivadas de médula ósea y células inmaduras en pacientes con leucemia, fueron utilizados para el análisis multidimensional de las células de las pacientes en muestras antes y después de la quimioterapia tanto ex vivo como en respuesta a un estímulo in vitro. Los resultados de esta tesis muestran que el sistema de inmuno-monitoreo implementado permite evidenciar una asociación entre la respuesta clínica del tumor a la quimioterapia con A/C con una recuperación de la funcionalidad de la respuesta inmune celular en pacientes con cáncer de mama en terapia neo-adyuvante. Consideramos que la restitución de algunas funciones analizadas en LT y DCs en respuesta al tratamiento podrían tener valor predictivo de la respuesta clínica del tumor previo a la aplicación de la quimioterapia neo-adyuvante con A/C. Metodología Para implementar el modelo de inmuno-monitoreo, fue necesario establecer diferentes condiciones de cultivo in vitro que permitiesen evidenciar la funcionalidad de LT y células presentadoras de antígeno (APC) en muestras de sangre periférica obtenidas de donantes sanas como de pacientes con cáncer de mama antes y posterior al tratamiento con tres ciclos de quimioterapia neo-adyuvante con A/C. Inicialmente se optimizó la generación de dos tipos diferentes de DCs maduras derivadas de monocitos en dos días (tipo estándar y tipo alfa), necesarias para activar respuestas Th1, citotóxicas y foliculares. Estas DCs se emplearon en dos sistemas de cultivo in vitro implementados con el fin de evaluar, el primero la respuesta de LT de memoria específicos de antígenos tumorales y el segundo para determinar la presencia de LT específicos de estos antígenos dentro del compartimento de LT vírgenes. Por otra parte, se midieron la frecuencia y estatus inmunológico de dos sub-poblaciones de DCs, de LT-CD4 FoxP3+ reguladores y Células Supresoras de Origen Mieloide (MDSCs) ex vivo y el grado de respuesta al estímulo de LT y de DCs in vitro. Los resultados de CF se analizaron tanto por la estrategia manual (software FlowJo) como con el empleo de algoritmos automatizados como FLOCK, SPADE y CITRUS con el fin de establecer correlación entre los resultados de estos análisis con la respuesta clínica del tumor a la quimioterapia. Resultados La implementación del sistema de inmuno-monitoreo de individuos sanos y de pacientes con cáncer de mama permitió establecer la utilidad como APCs profesionales de dos fenotipos funcionales de DCs derivadas de monocitos en dos días cuyas características fenotípicas y funcionales son indistinguibles de DCs clásicas derivadas en siete días. La evaluación de LT específicos de antígenos en una paciente “modelo” en remisión completa luego de nueve años de tratamiento antitumoral, permitió evidenciar que LT-CD8+ específicos de un antígeno tumoral que infiltraban el tumor al momento del diagnóstico experimentaron un incremento de su frecuencia en sangre varios meses después de la terapia antitumoral. El monitoreo en esta paciente evidenció un fenotipo de inmunosupresión de los componentes APCs y LT. Mientras las APCs mostraron una deficiente respuesta a estímulos pro-inflamatorios y secreción de IL-12p70, los LT respondieron de manera deficiente en respuesta a la estimulación del TCR. De manera notable, estas evidencias de la deficiente respuesta inmune celular en esta paciente se recuperaron de manera significativa luego de la terapia antitumoral. Por su parte el monitoreo de APCs y LT en el grupo de pacientes antes de tres ciclos de quimioterapia neo-adyuvante con A/C reveló las mismas deficiencias funcionales en APCs y LT observadas en la paciente “modelo” previo a la terapia antitumoral. Luego de instaurada la terapia neo-adyuvante con A/C la funcionalidad de estas células alcanzó niveles similares a los observados en las células de mujeres sanas, más aún, en estas pacientes la recuperación de algunos fenotipos funcionales pudo ser correlacionada de manera predictiva con la respuesta clínica del tumor a la quimioterapia con A/C. Finalmente, el análisis automatizado del inmuno-monitoreo con SPADE, FLOCK y CITRUS, permitió confirmar los resultados obtenidos con el análisis manual y además establecer el fenotipo de poblaciones complejas que diferencian el grado de respuesta inmune de personas sanas de muestras obtenidas de pacientes con cáncer de mama. Conclusiones Tomados en conjunto, los resultados obtenidos permiten proponer un modelo de inmuno-monitoreo como herramienta útil para evidenciar en muestras de sangre de pacientes con cáncer de mama la capacidad inmuno-estimulante de la quimioterapia con A/C. Algunos de los parámetros analizados permiten predecir con base en la respuesta funcional del sistema inmune antes de iniciado el tratamiento el grado de respuesta clínica de las pacientes al tratamiento con A/C. Los algoritmos de análisis automatizado son aplicables para los análisis de CF complejos facilitando el procesamiento de múltiples muestras y la identificación de sub-poblaciones celulares que pudiesen ser utilizadas como posibles bio-marcadores característicos del estatus de LT pre-quimioterapia. Este modelo de inmuno-monitoreo actualmente se utiliza para el seguimiento de la respuesta a la vacunación con DCs en el primer ensayo clínico de inmunoterapia fase I/II en nuestro medio en pacientes con cáncer de mama en terapia neo-adyuvante con A/C.
Péptidos derivados de lactoferricina bovina como agentes anticancerígenos contra el carcinoma de células escamosas de la cavidad oral.
(2016-09-15) Solarte David, Víctor Alfonso; Arango Rodríguez, Martha Ligia (Thesis advisor)
El carcinoma de células escamosas de la cavidad oral (OSCC) se encuentra entre los 10 tipos de cáncer más frecuentes en el mundo, siendo uno de los de peor pronóstico y con una de las tasas más bajas de supervivencia. Los tratamientos actuales para esta enfermedad causan graves efectos secundarios y tienen un éxito limitado, lo cual hace prioritario el desarrollo de nuevas alternativas terapéuticas que sean más efectivas y que permitan incrementar la expectativa y la calidad de vida de los pacientes. La finalidad del presente trabajo consistió en diseñar y evaluar posibles nuevos fármacos basados en péptidos derivados de la Lactoferricina Bovina lineal (LfcinB25) como alternativa terapéutica para el OSCC. Con este propósito, se sintetizaron diferentes péptidos lineales cortos derivados de la LfcinB25 los cuales se evaluaron in vitro en las líneas celulares de OSCC denominadas CAL27 y SCC15, utilizando como control una línea no tumoral de queratinocitos inmortalizados, la línea Het-1A. Los resultados evidenciaron que los péptidos lineales con el dominio RRWQWR (LfcinB(20-25)), presentaron una actividad citotóxica moderada en las células cancerígenas. A partir de estos resultados se diseñaron los péptidos LfcinB-Pal (péptido lineal palindrómico derivado del péptido LfcinB(20-25)) y LfcinB(20-25)4 (péptido tetramérico sintetizado a partir del péptido monomérico LfcinB(20-25)); se encontró que el péptido LfcinB-Pal presentó una citotoxicidad en la línea celular CAL27 que igualó el efecto citotóxico de la LfcinB25 (65%), no obstante, su citotoxicidad fue baja en la línea SCC15 (40%), en contraste el péptido LfcinB(20-25)4 causó una citotoxicidad significativa (90%) en las líneas de OSCC, superando el efecto citotóxico de los péptidos lineales. El péptido tetramérico mostró selectividad por las células de OSCC al presentar una menor citotoxicidad en la línea celular no tumoral Het-1A (62%), además no presentó un efecto hemolítico a menos que la concentración del péptido fuese 5 veces mayor a la evaluada en las líneas celulares. El efecto citotóxico in vitro del péptido tetramérico en las células de OSCC fue rápido; este péptido indujo la formación de vesículas, la reducción del tamaño celular, la permeabilidad de la membrana celular y la pérdida de adherencia de las células luego de una hora de tratamiento, desencadenando la muerte celular por necrosis. Evaluaciones realizadas por microscopia electrónica permitieron evidenciar que el péptido tetramérico causó daños severos en la membrana celular y en las estructuras internas de las células de OSCC, en contraste, los daños estructurales causados en las células de Het-1A fueron menores, lo cual pone en evidencia su selectividad hacia células tumorigénicas. Nuestros resultados también mostraron que los péptidos eran rápidamente degradados por los metabolitos secundarios producidos por las células de OSCC in vitro. Con estos precedentes el péptido tetramérico se evaluó en un modelo in vivo de OSCC desarrollado en Hámster dorado. Luego de tratar a los animales con 15 dosis del péptido administrado de forma intratumoral (3 veces por semana), se encontró una reducción significativa en el volumen de los tumores, cuando el péptido se suministró a una concentración de 100 µg/mL. De manera particular se encontró que a concentraciones mayores (200 µg/mL y 300 µg/mL) su efecto antitumoral no fue significativo. Nuestros resultamos evidenciaron que luego de la tercera dosis con el péptido (tratamiento agudo), los tumores tratados a 100 µg/ml presentaron una frecuencia mayor de células en apoptosis, en tanto que a 300 µg/mL se presentó un número significativo de células en necrosis, mientras que los tumores tratados con 200 µg/mL, presentaron células tanto en necrosis como en apoptosis. Es decir que el péptido tetramérico presentó un efecto antitumoral diferencial que es dependiente de la dosis cuando se suministró de manera aguda. Luego de las 15 dosis de tratamiento (tratamiento crónico), todos los tumores tratados a 100 µg/mL, 200 µg/mL y 300 µg/mL presentaron principalmente células en apoptosis. Adicionalmente, se encontró que el péptido LfcinB(20-25)4 causó acelularidad en el parénquima del tumor e indujo una infiltración leucocitaria que fue proporcional a la dosis administrada, severa en los tumores tratados con 300 µg/mL, y leve en los tratados a 100 µg/mL Estos hallazgos sugieren que este péptido tetramérico a una dosis óptima, podría ser considerado como un nuevo candidato para el tratamiento terapéutico del OSCC.
Producciónn xeno-free de Células Madre Mesenquimales derivadas de tejido adiposo, y evaluación de su secretoma neovasculairzante
(2016) Escobar Soto, Carlos Hugo
Introducción. Las moléculas de origen animal o bacteriano que habitualmente son usadas en los protocolos de extracción, cultivo y criopreservación de Células Madre derivadas de Tejido Adiposo humano (human Adipose derived Stem Cells, hASC) significan un riesgo de rechazo inmunológico contra las células trasplantadas y/o desarrollo de zoonosis. La capacidad de inducir la regeneración tisular de las ASC, depende al menos en parte, de factores de efecto paracrino liberados por ellas. Pero también se ha demostrado que la capacidad de inducir regeneración tisular, tiene una relación inversa con el pase al que se encuentran las células. Caracterizar el secretoma neovascularizante de las hASC, es una forma adecuada de evaluar el impacto de la producción xeno-free y el pase celular, sobre el potencial regenerador de las células. Materiales y Métodos. Después de desarrollar un protocolo de producción xeno-free para las hASC, las células fueron caracterizadas de acuerdo a su inmunofenotipo y potencial de diferenciación. Después de recolectar el medio condicionado (MC) por las hASC de cuarto y séptimo pase, con un arreglo de anticuerpos se evaluó cualitativa, cuantitativamente el secretoma de las hASC xeno-free, comparándolo con el de las células producidas en condiciones estándar. Además se evaluó la capacidad funcional de estos MC en ensayos de formación de tubos en matrigel, explantes de anillos de aorta y un modelo in vivo de isquemia tisular periférica. Resultados. Nosotros desarrollamos un procedimiento libre de riesgo xenogénico para la producción de hASC que cumplen con los criterios de la Sociedad Internacional de Citoterapia. Todos los factores detectados con el arreglo de anticuerpos fueron secretados por las hASC en ambas condiciones de producción celular y en ambos pases celulares. Las hASC producidas bajo condiciones xeno-free secretaron mayor concentración de EGF, PDGF-BB, Leptina, IFN-γ, CCL1, CCL7, CXCL11, GM-CSF y G-CSF. Las células de séptimo pase producidas bajo condiciones estándar secretaron mayor concentración de algunos factores antineovascularizantes como TIMP-2, angiostatina, CXCL-11 y las formas solubles de Tie-2 y VEGFR3. El MC de las hASC xeno-free tuvo menor capacidad funcional en el ensayo de matrigel, aunque mayor capacidad funcional en los ensayos de anillos de aorta y en el modelo in vivo, que el MC de las células producidas en condiciones estándar. El pase celular se asoció con la reducción de la capacidad neovascularizante de las células producidas bajo condiciones estándar. Conclusiones. La producción xeno-free no altera significativamente la capacidad neovascularizante de las hASC, lo cual sugiere que bajo estas condiciones de producción, conservan la capacidad de inducir regeneración tisular. El pase celular se asocia con pérdida significativa de la capacidad neovascularizante de las hASC producidas bajo condiciones estándar.
Caracterización funcional de un canal de cloruro CLC de Leishmania
(2016) Garcia Otalora, Michel Andrés; Posada Buitrago, Martha Lucia (Thesis advisor)
Leishmania spp., abarca organismos unicelulares eucariota con un ciclo de vida caracterizado por dos grandes estadíos (promastigote y amastigote) expuestos a diferencias de pH, osmolaridad y temperatura. Dados estos cambios, se espera que el parásito desarrolle mecanismos regulatorios para su supervivencia. Estudios previos en promastigotes han descrito bombas H+ ATPasas que generan un gradiente electroquímico útil para el transporte secundario de nutrientes (Zilberstein and Shapira, 1994), y que están acopladas a transportadores aniónicos (Vieira, Slotki, and Cabantchik, 1995; Vieira, Lavan, Dagger, and Cabantchik, 1994). Hasta el momento, se conoce poco respecto a la naturaleza molecular o al papel que desempeñan éstas moléculas en la fisiología de Leishmania spp., pero se ha observado que su inhibición, altera transporte de aminoácidos, volumen celular (Vieira, Lafuente, Gamarro, and Cabantchik, 1996), pH intracelular (Vieira et al., 1994), y potencial de membrana (Vieira et al., 1995). Para iniciar el estudio de transportadores aniónicos en Leishmania el grupo de Biofísica y biología de membranas registró corrientes rectificadoras de salida, voltaje y Cl- dependientes, inhibidas por ácido 4,4'- diisotiocianostilbeno- 2,2'-disulfónico (DIDS), luego de la microinyección de mRNA total poliadenilado de promastigotes estacionarios de L. L. amazonensis (Lagos, Moran, and Camacho, 2007) y L. V. braziliensis (Garzón, Stühmer, and Camacho, 2009) en ovocitos de Xenopus laevis. Estas corrientes tienen características electrofisiológicas de canales de cloruro voltaje dependientes o CLC (por sus siglas en inglés). Así, se exploró el genoma de L. V. braziliensis encontrando cuatro secuencias codificantes para canales de cloruro que eran CLC putativas (Quintero, 2014; Parada, 2014; Carreño, 2015). La expresión ha sido verificada para tres de estos genes en promastigotes y para todos ellos en amastigotes in situ de L. V. braziliensis (Carreño, 2015). A la fecha LbCLC-A, LbCLC-B y LbCLC-C han sido clonados (Lozano Jiménez, 2012; Quintero, 2014; Parada, 2014). Este trabajo se enfoca en la caracterización funcional de LbCLC-B. Esta proteína se detecta en estructuras puntiformes intracelulares en promastigotes de L. V. braziliensis. LbCLC-B posee localización diferencial respecto a LbCLC-A y LbCLC-C en promastigotes. Marcajes dobles (golgina 97-LbCLC-B) indican co- localización parcial con el Complejo de Golgi. Su patrón de expresión difiere dependiendo de la etapa del parásito, siendo puntiforme localizado perinuclear y perikinetoplástico en promastigotes en división e inmaduros, para volverse puntiforme distribuido en todo el citoplasma en promastigotes maduros. Se sugiere además que LbCLC-B es reclutada durante lesión celular por daño osmótico. Inyección de cRNA LbCLC-B en ovocitos de X. laevis altera su volumen. Registros electrofisiológicos de voltage clamp con dos electrodos 48 horas post-inyección muestran corrientes rectificadoras de salida, voltaje dependientes que se incrementan a pH 5 y cuyo potencial de reversión es sub- nernstiano sugestivo de actividad como intercambiador. Se encontró evidencia de la participación de LbCLC-B en la regulación del volumen en promastigotes de Leishmania mediante ensayos de interferencia en la expresión. Se escogieron dos líneas de parásitos que presentaban alteraciones en el patrón de expresión de α-tubulina. En una de estas líneas se encontró una disminución regulatoria del volumen inducida en medio hipotónico sugestivo de interferencia. Con base en los hallazgos se propone que LbCLC-B estaría involucrado en la regulación del volumen.
Efecto del silenciamiento de los genes PINK1 y Parkin sobre la dinámica y autofagia mitocondrial en un modelo de neuronas dopaminérgicas
(2016-04-01) Contreras Zárate, María José
Introducción: La etiología de la Enfermedad de Parkinson (EP) aun es desconocida, la evidencia aportada por mutaciones en PINK1 y Parkin, así como modelos neurotóxicos sugiere que la EP se asocia a disfunción mitocondrial, pero no se conocen muchos de los mecanismos moleculares que la subyacen. Objetivo: Evaluar el efecto del silenciamiento de los genes PINK1 y Parkin sobre la fisiología mitocondrial y autofagia en células CAD expuestas a C2-ceramida. Metodología: Usando plásmidos lentivirales, se silenciaron los genes PINK1 y Parkin en la línea neuronal dopaminérgica CAD, se evaluaron cambios en viabilidad y vías de supervivencia neuronal, diferenciación, dinámica mitocondrial y autofagia en presencia de un reto neurotóxico inducido por C2-Ceramida. Resultados: el silenciamiento de PINK1 alteró la señalización del IGF1R, lo cual indujo una disminución en la activación de la proteína AKT y HKI, generando pérdida del potencial de membrana mitocondrial, incremento en el fraccionamiento de la red de mitocondrias y fallo en la mitofagia. La deficiencia de Parkin disminuyó los niveles de pERK y alteró la degradación de autofagosomas. Estos factores condujeron a una mayor susceptibilidad al tratamiento con ceramida y finalmente promovieron muerte neuronal. La sobre-expresión de Parkin recuperó el flujo autofágico en las células deficientes de PINK1 o Parkin y protegió de la muerte neuronal inducida por deprivación de nutrientes y ceramida. Conclusión: La deficiencia de PINK1 y Parkin induce muerte neuronal asociada con disfunción en vías de supervivencia, alterando el metabolismo, la dinámica mitocondrial y la autofagia.
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
(2015-11) Hernández Hincapié, Hernán Guillermo
El presente trabajo de doctorado estudia el estado de metilación de ADN del genoma (metiloma) en capas de neuronas piramidales corticales las cuales tienen susceptibilidad conocida en la Enfermedad de Alzheimer (EA) y realiza adicionalmente un análisis de expresión a nivel transcripcional en neuronas piramidales de igual localización al estudio de metiloma. Además, estudia el metiloma de ADN en leucocitos de sangre periférica para lo cual, mediante un cuidadoso ensamblaje de datos disponibles en diferentes repositorios, se logró realizar un análisis original de metilación de ADN en EA, que tal vez sea el más grande de metiloma de ADN en sangre periférica en EA realizado a la fecha. En cerebros, resaltan dentro de los múltiples resultados, la hipermetilación diferencial en genes como BIN1 y HOXA3 que igual que KDM2B y ZNF385A, son concordantes con los hallazgos de otros autores también en cerebros humanos con EA. Las regiones diferencialmente metiladas en cerebros incluyen principalmente los genes GSTP1, CXXC1/ MBD1 y MBP. De forma importante, también se encontró una región del gen MBP en el estudio de sangre, que coincide exactamente con el estudio en cerebros; en dicha región (coordenadas hg19 chr18:74799495-572) se encuentran 3 CpGs consecutivos que concuerdan en ambos estudios. Estos hallazgos representan nuevo conocimiento aportado al área.
Evaluación de la regeneración axonal en ratas con sección medular aguda y crónica después del trasplante con células de la glía envolvente olfatoria Y Afgf
(2015) Botero Espinosa, Lucía
La lesión medular es un evento catastrófico, que afecta no sólo al paciente sino a los miembros de la familia y a la sociedad(DeVivo and Chen, 2011)(DeVivo and Chen, 2011)(DeVivo and Chen, 2011)(DeVivo and Chen, 2011)(DeVivo and Chen, 2011). Para el tratamiento de esta patología se han probado diversas terapias entre las cuales está la terapia celular con células de la glía envolvente olfatoria (CGEO). Éstas se han probado en diversos modelos de lesión medular aguda, sin embargo, la combinación con aFGF no ha sido evaluada en lesión crónica. En este trabajo se probó la combinación de CGEO+aFGF en un modelo de lesión medular completa en ratas en las fases aguda y crónica de la lesión. Se usaron 28 ratas Wistar machos SPF, (14 con lesión crónica y 14 con lesión aguda) que se sometieron a cirugía de laminectomía y sección medular completa. Las ratas de lesión aguda se trasplantaron en el mismo acto quirúrgico de la lesión; las ratas de lesión crónica se sometieron a una segunda cirugía, sesenta días después, en la cual se aplicó el trasplante de CGEO+aFGF. Mediante evaluaciones funcionales, durante 75 días post trasplante, se demostró que las ratas trasplantadas presentaron recuperación motora y sensitiva tanto en la fase aguda como en la crónica, mostrando puntajes variables en la escala motora BBB (entre 4 y 14) y mayor agarre en la rejilla, en comparación con las ratas de los grupos control las cuales no tuvieron recuperación funcional. La evaluación por microscopía confocal demostró que el trasplante indujo regeneración de axones en los segmentos craneal y caudal de la lesión, así como en el epicentro de la misma, donde se observaron axones regenerados atravesando la cavidad y uniendo los segmentos. El trasplante también disminuyó la cicatriz glial y el tamaño de los AS reactivos. El análisis ultraestructural demostró la presencia de focos de remielinización en los animales trasplantados en las dos fases de la lesión. Estos focos de remielinización se caracterizaron por tener morfología compatible con mielina central y periférica. Estos resultados confirman el efecto positivo del trasplante de CGEO+aFGF en inducir recuperación en lesión medular y abren el paso a nuevos etapas para su aplicación en terapia celular y reparación nerviosa.

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