Identificación del gen codificante para la Proteína Disulfuro Isomerasa 2 de Leishmania braziliensis y aproximación experimental para su deleción mediante CRISPR/Cas9

Abstract

La leishmaniasis es una enfermedad parasitaria causada por protozoos flagelados del género Leishmania, existiendo 20 especies que pueden infectar al ser humano, 9 de las cuales están presentes en el territorio colombiano. La enfermedad se clasifica en las formas cutánea (LC), mucocutánea (LMC) y visceral (LV). En Colombia, en el año 2023 se presentaron 4219, 84 y 3 casos de LC, LMC y LV, respectivamente. Leishmania braziliensis es el agente etiológico más común de LC y LMC en América Latina. Actualmente, no existen vacunas avaladas para uso humano contra la leishmaniasis, cuyo tratamiento depende del uso de medicamentos que resultan ineficaces dada su toxicidad y la presencia de cepas fármaco-resistentes. Una de las proteínas que se expresa en cepas altamente virulentas es la Proteína Disulfuro Isomerasa 2 (PDI-2), enzima tiol-disulfuro oxidorreductasa que cataliza la formación, reducción e isomerización de enlaces disulfuro a nivel del retículo endoplasmático (RE), contribuyendo con la proteostasis celular. En L. major, la inhibición enzimática de PDI-2 disminuye significativamente sus tasas de crecimiento, mientras que la sobre-expresión de una versión inactiva en promastigotes de L. donovani altera la secreción de fosfatasas alcalinas provenientes del RE, necesarias para la infección. Estas observaciones sugieren que PDI-2 constituye un blanco terapéutico promisorio, cuyo estudio en L. braziliensis, la especie predominante en Colombia, aún no se ha realizado. En consecuencia, en este trabajo se abordó la identificación y caracterización bioinformática de un candidato para PDI-2 en L. braziliensis (LbPDI2), incluyendo la expresión de la proteína recombinante 6xHis-SUMO-∆ALbPDI2, truncada en uno de sus dominios tiorredoxina N-terminales. Adicionalmente, se obtuvieron parásitos mutantes LbPDI2-/- mediante el sistema de edición CRISPR/Cas9. Análisis de viabilidad celular basados en EC50, indicaron que los parásitos mutantes aumentaron su resistencia al antimonio trivalente, principio activo de los medicamentos de primera línea contra la enfermedad, así como al 5-fluorouracilo, metotrexato, sulfato de zinc y genisteína, pero haciéndose más susceptibles a la geneticina 418, estreptomicina y ketoconazol. En relación con la anfotericina B, el peróxido de hidrógeno y el nitroprusiato de sodio, no se detectaron cambios en relación con los parásitos control (Wild Type, WT). Por otra parte, se inició la exploración de ensayos de muerte celular mediante citometría de flujo, así como una aproximación metabolómica, lográndose establecer condiciones experimentales de partida para eventuales ensayos que permitan identificar cambios moleculares en los parásitos mutantes ante el tratamiento con diversas sustancias. En conjunto, los resultados derivados del presente estudio sugieren la participación del candidato LbPDI2 en la defensa del parásito contra sustancias antimicrobianas y anticancerígenas, posicionándose como una potencial diana farmacológica contra la leishmaniasis (Texto tomado de la fuente).

Leishmaniasis is a parasitic disease caused by flagellate protozoa of the genus Leishmania, with 20 species that can infect humans, 9 of which are present in Colombia. The disease is classified into cutaneous (CL), mucocutaneous (MCL) and visceral (VL) forms. In Colombia, 4219, 84 and 3 cases of CL, MCL and VL occurred in 2023, respectively. Leishmania braziliensis is the most common etiologic agent of CL and MCL in Latin America. Currently, there are no vaccines approved for human use against leishmaniasis, the treatment of which depends on the use of drugs that are ineffective due to their toxicity and the presence of drug-resistant strains. One of the proteins expressed in highly virulent strains is Protein Disulfide Isomerase 2 (PDI-2), a thiol-disulfide oxidoreductase enzyme that catalyzes the formation, reduction and isomerization of disulfide bonds at the endoplasmic reticulum (ER), contributing to cellular proteostasis. In L. major, enzymatic inhibition of PDI-2 significantly decreases its growth rates, while overexpression of an inactive version in L. donovani promastigotes alters the secretion of alkaline phosphatases from the ER, which are necessary for infection. These observations suggest that PDI-2 is a promising therapeutic target that has not yet been studied in L. braziliensis, the predominant species in Colombia. Accordingly, this work addressed the identification and bioinformatic characterization of a candidate for PDI-2 in L. braziliensis (LbPDI2), including the expression of the recombinant 6xHis-SUMO-∆ALbPDI2 protein, truncated in one of its N-terminal thioredoxin domains. Additionally, LbPDI2-/- mutant parasites were obtained using the CRISPR/Cas9 editing system. Cell viability analyses based on EC50 indicated that the mutant parasites increased their resistance to trivalent antimony, as well as to 5-fluorouracil, methotrexate, zinc sulfate, and genistein, but became more susceptible to geneticin 418, streptomycin, and ketoconazole. In relation to amphotericin B, hydrogen peroxide and sodium nitroprusside, no changes were detected in relation to control parasites (Wild Type, WT). On the other hand, the exploration of cell death assays by flow cytometry was initiated, as well as a metabolomic approach, establishing experimental conditions for eventual assays to identify molecular changes in the mutant parasites upon treatment with different substances. The results derived from the present study suggest the participation of the candidate LbPDI2 in the defense of the parasite against antimicrobial and anticancer substances, positioning it as a potential pharmacological target against leishmaniasis.