Evaluación de la presencia de una proteína cuyo gen ha sido expresado diferencialmente en el contexto de macrófagos humanos infectados con Leishmania spp.

Abstract

Investigaciones sobre la expresión genética de macrófagos infectados por diferentes especies de Leishmania en diferentes modelos celulares, han identificado a las metalotioneinas como genes modulados positivamente durante la infección, implicándolas en el proceso. Sin embargo, estos estudios de expresión genética no han validado la presencia de MT a nivel de proteína durante la infección. En la presente investigación se evaluó por medio de inmunofluorescencia, la dinámica de expresión proteica de las metalotioneinas en macrófagos derivados la línea celular U937 (Macrófago U937) no infectados e infectados con Leishmania braziliensis, a las 0h, 24h, 48h y 72h post-infección. Además, se determinó por medio de RT-PCR, cuales isoformas de metalotioneina son expresadas en los macrófagos U937 no infectados e infectados por Leishmania braziliensis. Se mostró la presencia de MT a nivel de proteína en los macrófagos U937 infectados, sobre los cuales se encontró diferencia en los niveles de expresión respecto de los macrófagos U937 no infectados. También, se identificó un patrón de distribución caracterizado por un aumento en la intensidad de fluorescencia de MT sobre lo que posiblemente corresponde al cuerpo del parasito dentro del citoplasma de los macrófagos U937 infectados. Este patrón de distribución se denominó fenotipo tipo vesicular. Además, se identificó las isoformas de metalotioneina expresadas en macrófagos U937 no infectados e infectados por Leishmania braziliensis: MT1E, MT1F, MT1G, MT1X y MT2A. Finalmente, se diseñaron shRNAs para silenciamiento simultaneo y específico para cada una de las MTs expresadas en macrófagos U937 infectados por Leishmania braziliensis. Los resultados obtenidos sugieren que las metalotioneinas están involucradas durante la infección por L. braziliensis.

Abstract. Studies on gene expression in macrophages infected by different Leishmania species have been identified the metallothionein genes modulated positively during infection involving them in the process. However, these gene expression studies were not validated the presence of MT protein level during infection. In the present investigation was assessed by immunofluorescence , the dynamics of protein expression of metallothioneins in macrophage -derived cell line U937 (macrophage U937) uninfected and infected with Leishmania braziliensis , at 0h , 24h, 48h and 72h post- infection . In addition , it was determined by RT -PCR, which metallothionein isoforms are expressed in the macrophages U937 infected and uninfected by Leishmania braziliensis. This investigation showed the presence of MT protein level in infected U937 macrophages for which differences were found in the expression levels compared to the uninfected U937 macrophages. Distribution pattern characterized by an increase in fluorescence intensity of MT on possibly corresponds to the body of the parasite within the cytoplasm of macrophages infected U937 are also identified. This distribution pattern is called phenotype like vesicule. Also, metallothionein isoforms expressed in U937 macrophages uninfected and infected by Leishmania braziliensis was identified: MT1E, MT1F, MT1G, MT1X and mT2a. Finally, shRNAs were designed for simultaneous and specific to each of the MTs expressed in macrophages infected with Leishmania braziliensis U937 silencing. The results suggest that metallothioneins are involved during infection by L. braziliensis.