Generación de una línea de macrófagos con expresión del represor de tetraciclina para su implementación en un modelo de silenciamiento genético inducible

Abstract

La línea promonocítica U937 ha sido utilizada como modelo in vitro para estudios de infección de patógenos intracelulares, fisiopatología del cáncer y procesos de diferenciación celular. En este proyecto se generó una línea celular derivada de la línea U937, con expresión estable del represor de tetraciclina (U937-TR+) para utilizarla eventualmente en un sistema de silenciamiento genético inducible mediado por miRNA. La generación de la línea U937-TR+ se logró mediante transfección por lipofectamina de la línea U937 con el plásmido pcDNA™6/TR (4 ug DNA:8 ul Lipofectamina) y el mantenimiento de estas células en medio selectivo (RPMI 1640, SFB 10%, 5ug/ml de blasticidina). El tiempo de duplicación de las células U937-TR+ es mayor (29,7 horas) que el de la línea U937 (21,2 horas) y no hubo diferencias significativas en el porcentaje de diferenciación a macrófagos en respuesta a 50 ng/ml de PMA (1,25*105 células/ml, 5 días de incubación) entre ambas líneas. Para evaluar su utilidad en un sistema de silenciamiento inducible, se transfectaron células U937-TR+ con un constructo inducible que codificaba de manera cocistrónica para la proteína EmGFP y un miRNA no relevante, cuya expresión era controlada por el promotor CMV y la región operadora de unión del represor de tetraciclina; en presencia de tetraciclina (1ug/ml), hubo expresión de EmGFP, aunque la eficiencia de la transfección fue menor del 1%. La línea U937-TR+ es la base para implementar un modelo in vitro que permitirá identificar y caracterizar sistemáticamente los genes del macrófago necesarios para que se produzca la infección y supervivencia de parásitos del género Leishmania. / Abstract. U937 promonocytic cell line has been used as in vitro model to study intracellular pathogen infection, cancer physiopathology and cell differentiation events. In this study, U937 cell line with stable expression of tetracycline repressor (U937-TR+) was generated, in order to be used during the implementation of a miRNA-mediated inducible gene silencing model. U937-TR+ cells were generated by cationic lipid transfection of U937 cells with pcDNA™6/TR plasmid (4ug DNA, 8 ul Lipofectamine) and cell culture in selective media (RPMI supplemented with 10% FBS and 5 ug/ml blasticidine). U937-TR+ cell duplication time is greater (29,7 hours) than U937 (21,2 hours); however, there was no statistically significant differences in terms of macrophage differentiation percentage in response to phorbol ester stimuli (50 ng/ml PMA) between both cell lines (1,25 * 105 cells/ml, 5 days of incubation). In order to evaluate U937-TR+ usefulness in an inducible gene expression model, these cells were transfected with an inducible expression construct that encodes for EmGFP and non-relevant miRNA sequences under CMV promoter and tetracycline operator control element. After tetracycline addition (1ug/ml), transfected U937-TR+ cells expressed EmGFP, but transfection efficiency was low ( 1%). U937-TR+ cell line is the first step to build an in vitro model for the systematic identification and characterization of macrophage genes that are required for Leishmania parasite infection and intracellular development.