Estudio de las Nicotinamida Mononucleótido Adenilil Transferasas (NMNATs) de parásitos protozoos: Determinación de su bifuncionalidad como chaperonas moleculares e implementación de una metodología para su detección

Abstract

Ciertas proteínas poseen la capacidad de ejercer más de una función, propiedad conocida como moonlighting. Las proteínas que más presentan esta característica son enzimas que tienen como actividad canónica rutas del metabolismo energético basal. Para que las proteínas puedan desempeñar su función o funciones, es necesario que tengan una conformación nativa. Para lograr esta estructura dentro de la célula, es necesario que las proteínas sean asistidas por las chaperonas moleculares. Las Nicotinamida Mononucleótido Adenilil Transferasas (NMNATs), además de su rol como paso final en la síntesis del nucleótido de nicotinamida y adenina (NAD+), les ha sido descrita una función moonlight como chaperonas moleculares en varios organismos. Dada la alta importancia de las NMNATs, estas representan un blanco farmacológico relevante para el diagnóstico y tratamiento contra parásitos protozoos como Leishmania braziliensis, Trypanosoma cruzi, y Giardia lamblia, los cuales tienen una alta incidencia en salud pública en Colombia. Por esta razón, se planteó el estudio de las NMNATs de estos parásitos, con el fin de comprobar si cuentan con actividad chaperona, y la implementación de una herramienta de detección molecular en la forma de aptámeros (oligonucleótidos de ADN). Para lograr esto, se identificaron in silico regiones compartidas entre NMNATs chaperonas y las de los parásitos. De manera in vitro, se expresó y purificó la LbNMNAT desde Escherichia coli M15 transformadas con el plásmido pQE30lbnmnat y se evaluó la actividad chaperona mediante ensayos de agregación e inactivación. Además, se utilizó la metodología SELEX para seleccionar preliminarmente aptámeros afines a la 6xHisHsNMNAT3, una de las proteínas estudiadas en este trabajo (Texto tomado de la fuente).

Certain proteins have the ability to perform more than one function, a property known as moonlighting. The proteins that most often exhibit this characteristic are enzymes that have as canonical activity pathways of basal energy metabolism. For proteins to perform their function or functions, it is necessary for them to have a native conformation. To achieve this structure within the cell, proteins need to be assisted by molecular chaperones. Nicotinamide Mononucleotide Adenylyl Transferases (NMNATs), in addition to their role as the final step in the synthesis of nicotinamide adenine nucleotide (NAD+), have been described moonlighting as molecular chaperones in several organisms. Given the high importance of NMNATs, they represent a relevant pharmacological target for the diagnosis and treatment of protozoan parasites such as Leishmania braziliensis, Trypanosoma cruzi, and Giardia lamblia, which have a high incidence on public health in Colombia. For this reason, the study of the NMNATs of these parasites was proposed, to check if they have chaperone activity, and the implementation of a molecular detection tool in the form of aptamers (DNA oligonucleotides). To achieve this, shared regions between chaperone NMNATs and those of the parasites were identified in silico. in vitro, LbNMNAT was expressed and purified from Escherichia coli M15 transformed with the plasmid pQE30lbnmnat and the chaperone activity was evaluated by means of aggregation and inactivation assays. In addition, the SELEX methodology was used to preliminarily select aptamers related to 6xHisHsNMNAT3, one of the proteins studied in this study.