Evaluación de Enterococcus faecium en un modelo de inflamación intestinal in vitro

Abstract

La microbiota del tracto gastrointestinal y su hospedero viven en equilibrio; sin embargo, múltiples factores como la alimentación, el estrés, y los antibióticos, entre otros, pueden desencadenar un desbalance intestinal causando respuesta inflamatoria en el hospedero, la cual al perpetuarse puede ocasionar enfermedades crónicas como enfermedad inflamatoria intestinal, cáncer colorrectal y obesidad. El uso de probióticos ha salido a la luz como una alternativa para modular la microbiota intestinal, mantener la homeostasis y disminuir la inflamación. Objetivo: Optimizar las condiciones de cultivo en cuanto a Suero Fetal Bovino (SFB), tiempo de maduración de las células y determinar la concentración citotóxica 50 de los LPS para la posterior evaluación del efecto antiinflamatorio del probiótico Enteroccocus faecium en un modelo de inflamación gastrointestinal in vitro usando LPS como promotores de inflamación. Métodos: Se evaluó la viabilidad celular cuando las células se cultivaron con diferentes concentraciones de SFB y días post-siembra. Adicionalmente, por el método de MTT se calculó la concentración citotóxica 50 de los LPS de Escherichia coli. Por último, usando el modelo de inflamación gastrointestinal planteado, se evaluó el efecto de la adición del probiótico Enterococcus faecium sobre la expresión de citoquinas pro y antiinflamatorias (TNF-α, IL-1, IL-8, IL-10) mediante la cuantificación relativa por RT-qPCR usando como referencia el gen constitutivo GAPDH. El diseño estadístico utilizado fue completamente al azar en un arreglo factorial 2x6 (6 condiciones experimentales y 2 momentos post-siembra), cada tratamiento tuvo un total de 6 réplicas. Resultados: No se observó diferencia estadísticamente significativa sobre la viabilidad celular cuando las células fueron cultivadas durante 12 días con 5% v/v SFB respecto a las células cultivadas durante 18 días con 10% v/v SFB. Adicionalmente, la CC50 de los LPS fue de 7mg/mL. Por último, se observó que la expresión de citoquinas proinflamatorias se ve atenuada cuando se tratan las células Caco-2 con Enterococus faecium, en relación a las no tratadas, donde la disminución fue de hasta 36% para IL-1, 41% en el caso de IL-8 y 50% para TNF-α, mientras que la expresión de IL-10 aumentó hasta en un 57% comparado con las células sin tratamiento. Conclusión: Las condiciones de cultivo para simular un modelo de inflamación intestinal in vitro fueron optimizadas a fin de disminuir el tiempo de preparación de las células y la concentración de SFB. Adicionalmente, fue posible determinar concentraciones de LPS aptas para el estudio de inflamación en células Caco-2. in vitro Finalmente, el tratamiento con el probiótico Enterococcus faecium mostró disminución en la expresión de citoquinas proinflamatorias, mientras potenció la expresión de IL-10 como citoquina antiinflamatoria en un modelo de inflamación in vitro. Por lo anterior, sería de gran interés realizar ensayos in vivo para una posterior aplicación en el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas.

Abstract: Gut microbiota and its host live in equilibrium ; however, multiple factors such as food, stress, and antibiotics, among others, can trigger an intestinal imbalance causing an inflammatory response in the host, which can lead to chronic diseases such as in flammatory bowel disease, colorectal cancer and obesity. The use of probiotics has come to light as an alternative to modulate the intestinal microbiota, maintain homeostasis and decrease inflammation. Objective: To optimize the culture conditions of fetal bovine serum(FBS), cell maturation time and determine the cytotoxic concentration 50 of the LPS for the subsequent evaluation of the anti-inflammatory effect of the probiotic Enteroccocus faecium in a model of gastrointestinal inflammation in vitro using LPS as promoters of inflammation. Methods : Cell viability was assessed when cells were cultured with different concen trations of FBS and post-sowing days. In addition, the cytotoxic concentration 50 of the Escherichia coli LPS was calculated by the MTT method. Finally, using the proposed gastrointestinal inflammation model, we evaluated the effect of the addition of the probiotic Enterococcus faecium on the expression of pro and antiinflammatory cytokines (TNF-α, IL-1, IL-8, IL-10) by quantification relative by RT -qPCR using GAPDH as reference constitutive gene. The statistical design used was completely randomized in a 2x6 factorial arrangement (6 experimental conditions and 2 post -sowing moments), each treatment had a total of 6 replicates. Results: No statistically significant difference was observed in cell viability when cells were cultured for 12 days with 5% v/v FBS compared to cells cultured for 18 days with 10% v/v FBS. Additionally the CC50 of the LPS was 7mg / mL . Finally, it was observed that the expression of proinflammatory cytokines is attenuated when Caco -2 cells are treated with Enterococus faecium , in relation to the untreated, where the decrease was up to 36% for IL -1, 41% in the case of IL-8 and 50% for TNF-α, whereas IL-10 expression increased up to 57% compared to untreated cells. Conclusion: Culture conditions to simulate a model of intestinal inflammation in vitro were optimized in order to decrease the time of preparation of the cells and the concentration of SFB. In addition, it was possible to determine concentrations of LPS suitable for the study of inflammation in vitro in Caco - 2 cells. Finally, treatment with the probiotic Enterococcus faecium caused decrease expression of proinflammatory cytokines, while potentiating the expression of IL - 10 as an anti-inflammatory cytokine in an in vitro model of inflammation. Therefore, it would be of great interest to carry out in vivo assays for subsequent application in the treatment of chronic inflammatory diseases.