Obtención de un péptido quimérico de alto peso molecular derivado de proteínas de Plasmodium falciparum

Abstract

Resumen Se realizó la síntesis de un péptido quimérico de 82 residuos derivado de cuatro proteínas del Plasmodium falciparum mediante la metodología de síntesis de péptidos en fase sólida (SPFS) utilizando química Fmoc y se evaluó tres estrategias sintéticas para optimizar la síntesis de este. Dos de las variaciones sintéticas realizadas presentaron un aumento moderado en la eficiencia sintética de esta quimera peptídica. Además, se evaluó la actividad biológica de este péptido. Inicialmente, se evaluó el efecto del calentamiento asistido por radiación microondas a la síntesis encontrando que el principal efecto del calentamiento fue la reducción de los tiempos de síntesis y la disminución de los acoples empleados para la formación del péptido quimérico, además, del aumento del rendimiento; se prosiguió a evaluar sustituciones de resina menores (0.15 meq/g, 0.10 meq/g y 0.08 meq/g) a la inicialmente evaluada de 0.20 meq/g para determinar si estas tenían un efecto positivo en la síntesis del péptido, es decir, un aumento en el rendimiento, el efecto de la sustitución de la resina fue moderado puesto que se observó varias especies delecionadas presentes en el trascurso de la síntesis, y se determinó que estas sustituciones de resina muestran cromatogramas con perfiles similares, sin embargo, la resina de sustitución de 0.15 meq/g presenta un mejor perfil cromatográfico y mayor porcentaje de recuperación, aun así la ineficiencia persiste y esta es marcada desde el acople 23, por esta razón se centró la atención en superar esta dificultad inicial pues esta repercute de manera significativa en la síntesis del péptido quimérico. En el siguiente paso se utilizó Cloruro de litio (LiCl) como gente caotrópico el cual está documentado como desestabilizador de estructuras secundarias tipo hojas beta y agregados, puesto que, este tipo de interacciones unos de los principales causantes de la ineficiencia sintética en péptidos de difícil obtención y de gran número de aminoácidos; sin embargo, su utilización no disminuyó la ineficiencia que se observa en el residuo 23. El péptido sintetizado asistido por radiación microondas en la resina de 0.15 meq/g fue purificado y evaluado funcionalmente presentando altos títulos de anticuerpos en comparación a los péptidos componentes de la quimera, además, presentó un control moderado de la parasitemía cuando se evaluó en modelo murino (BALB/c) contra dos cepas de malaria murina Plasmodium berghei y Plasmodium yoelii.

Abstract A chimeric 82-residue peptide containing four Plasmodium falciparum protein antigen fragments strategically placed into the chimera was synthesized by three different strategies for solid phase peptide synthesis (SPPS) in order to optimize optimal conditions for its production. In addition, the biological and immunological activity of the chimeric molecule was evaluated. Initially, the effect of synthesis methodologies assisted by microwave radiation on amino acid coupling to the growing peptide-chain showed that the main effect of microwave heating was the reduction of amino acid coupling time on the synthesis of the chimera. Smaller degrees of resin substitution were tested (0.15 meq/g, 0.10 meq/g y 0.08 meq/g) regarding the initial 0.20 meq/g resin-substitution, in order to assess a possible constructive effect that enhance the peptide overall yield production. Thus, the effect of resin substitution was moderated since several deleted species were present as observed during the course of the process, finding that these substitutions resin allow obtaining peptide products show chromatograms with similar profiles, however, the resin substitution 0.15 meq / g had a better chromatographic profile and purity, even so, the synthetic inefficiency persisted and this is marked from the 23rd coupling in ahead. For this reason attention was set on overcoming this initial synthetic difficulty because this would significantly affect the total synthesis of the chimeric peptide. Following synthetic tests included chaotropic agents such as lithium chloride (LiCl) which is a well-known as a secondary structure elements disruptor specially those consisted in beta-sheets and other more complex aggregates, being this type of molecular interactions responsibly of a number of synthetic hindrances for peptides harboring “difficult sequences” characterized by a large number of residues; however its use in this work was not useful for diminishing synthetic inefficiencies which became evident starting the 23rd coupling. Due to its characteristics and yield, the chimeric peptide of 82 residues synthesized assisted by microwave radiation on a 0.15 meq / g resin, was purified and subsequently evaluated by its functional properties in in vitro and in vivo assays. Antigenicity studies demonstrated that the 82-mere chimeric peptide stimulated high antibody titers regarding each of its peptide components, besides being non-toxic and non-hemolytic of eukaryotic cells. Remarkably the chimeric 82-residue peptide was able to control parasitemia levels of vaccinated groups of BALB/c mice which were later challenged with two different rodent malaria species, being P. berghei and P. yoelii.