Doctorado en Ciencias - Bioquímica

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Evaluación de la virulencia de un mutante de Mycobacterium tuberculosis defectivo en el transporte iónico mediado por una ATPasa tipo P, en modelos experimentales de infección
(Universidad Nacional de Colombia, 2025-02-26) López Ruíz, Gina Marcela; Soto Ospina, Carlos Yesid; Bioquímica y Biología Molecular de las Micobacterias
La tuberculosis (TB) continúa siendo uno de los principales problemas de salud pública a nivel mundial. Actualmente, el control de la tuberculosis se ve dificultado por la prevalencia de comorbilidades, las deficiencias en el diagnóstico, la baja eficiencia de la vacuna BCG, y el surgimiento de cepas resistentes a los compuestos antituberculosos. Esto supone una necesidad constante de desarrollar nuevas estrategias de control, para lo que se requiere una mejor comprensión de los mecanismos moleculares involucrados en las interacciones huésped-patógeno. En efecto, comprender el papel que desempeñan los componentes estructurales y funcionales involucrados en la evasión del bacilo a las condiciones de estrés durante la infección tuberculosa es de gran utilidad para identificar dianas alternativas de atenuación y construir racionalmente nuevas vacunas antituberculosas. En este sentido, estudios previos han sugerido el papel de las ATPasas tipo P en la homeostasis iónica, la virulencia y como posibles blancos de atenuación de Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Por lo anterior, el objetivo del presente trabajo ha sido evaluar la relevancia del transporte de cobre mediado por ATPasas tipo P, en la viabilidad y la virulencia de Mtb. Inicialmente, se evaluó el efecto de la deleción del gen que codifica la ATPasa tipo P1B, CtpA de Mtb (mutante MtbH37RaΔctpA) en la capacidad de respuesta del bacilo tuberculoso a condiciones de estrés in vitro, en comparación con la cepa silvestre y complementada. Se observó que, la disrupción de ctpA en el genoma de Mtb genera un fenotipo sensible frente agentes de estrés oxidativo (IC50 de H2O2 = 784 ± 41 μM) y nitrosativo (IC50 de NPS= 55.4 ± 1.6 μM), en comparación con la cepa tipo silvestre (IC50 de H2O2 = 1473 ± 9 μM; IC50 de NPS=142 ± 5 μM). Esta sensibilidad se ha relacionado con la incapacidad de la cepa mutante (MtbH37RaΔctpA) para evitar la acumulación intracelular de especies reactivas de oxígeno (ROS) y con la reducida capacidad de los lisados de las células completas del mutante para oxidar los sustratos orgánicos de la multicobre oxidasa de Mtb (MmcO): p-fenilendiamina (pPD) y 2,2-azino-bis (ácido 3-etilbenzotiazol-6-sulfónico) (ABTS). Sin embargo, ya que MtbH37RaΔctpA no mostró una alteración del crecimiento en respuesta a altas dosis de cobre en comparación con la cepa silvestre, y la deleción del gen ctpA en Mtb no indujo la acumulación de cobre en células sometidas a dosis tóxicas del metal. Los resultados sugieren fuertemente que CtpA no participa directamente en el mantenimiento de los niveles fisiológicos citoplasmáticos del cobre y que, en lugar de ello, el eflujo de cobre mediado por CtpA puede ser necesario para otras funciones, como la metalización y la actividad de cuproenzimas redox de Mtb, como MmcO. Por lo tanto, CtpA podría estar involucrada en la respuesta al estrés redox en Mtb. En segundo lugar, con el fin de establecer el potencial de ctpA como diana de atenuación de Mtb, se evaluó el efecto de la deleción de ctpA en la virulencia de MtbH37Rv utilizando un modelo de infección de macrófagos alveolares de la línea MH-S in vitro, y ratones BALB/c infectados en un modelo de TB pulmonar progresiva (in vivo). De manera interesante, se encontró que ctpA es requerido para la proliferación intracelular de Mtb en macrófagos alveolares infectados en presencia de cobre. Toda vez que, en ausencia de cobre no se encontraron diferencias significativas en la capacidad replicativa entre las cepas silvestre (MtbH37Rv), mutante (MtbH37RvΔctpA) y complementada (MtbH37RvΔctpA::ctpA) bal infectar macrófagos MH-S. Sin embargo, al suplementar con CuSO4 (50 µM), la tasa de proliferación intracelular de las cepas mutante, parental y complementada a los 6 días posinfeccion fue de 6.22 veces (5388.9 vs 33500 UFC/mL), 11.5 veces (20090.6 vs 231333 UFC/mL), y 8.09 veces (14373 vs. 116320 UFC/mL), respectivamente. Este hallazgo, combinado con la mayor expresión del gen que codifica para la subunidad catalítica de la NADPH oxidasa 2 (Nox2), mostrada por las células MH-S infectadas con la cepa mutante, y con la capacidad reducida para prevenir la generación de ROS en macrófagos infectados activados con 12-miristato 13-acetato de forbol (PMA), sugieren que la atenuación del mutante MtbH37RvΔctpA se debe probablemente a un efecto específico del cobre y a una posible interrupción de los mecanismos de respuesta al estrés redox generado durante la infección micobacteriana. Por su parte, al evaluar la infección en ratones BALB/c, se encontró que los ratones infectados con la cepa mutante (MtbH37RvΔctpA) mostraron un tiempo de supervivencia media mayor, y una carga bacteriana pulmonar significativamente menor que los animales infectados con la cepa parental. Esto sugiere que la atenuación de MtbH37RvΔctpA durante la fase aguda de la infección puede estar relacionada con defectos en los mecanismos de evasión del bacilo a la respuesta inmune innata del huésped. Por último, se evaluó de manera preliminar el posible uso de la deleción de ctpA en Mtb como blanco de atenuación en la construcción de un agente vacunal. Se encontró que la inmunización de ratones BALB/c con la cepa mutante (MtbH37RvΔctpA) protegió a los animales de la proliferación de las cepas de Mtb virulenta (MtbH37Rv) e híper-virulenta (Mtb900586) en los pulmones, a niveles similares a los mostrados por la vacunación con BCG. Resultado que ha aumenta nuestro interés en generar una segunda mutación no relacionada sobre esta cepa, con el fin de construir una cepap viva atenuada con potencial vacunal que genere una mayor protección que BCG. En conjunto, nuestros resultados sugieren que ctpA podría ser relevante para la virulencia de Mtb y ser un componente clave en los mecanismos de evasión del bacilo en respuesta al estrés redox generado por las células fagocíticas durante la progresión de la infección tuberculosa. Razón por la cual, su deleción podría favorecer la reactivación de diversas funciones efectoras adicionales en macrófagos, que contribuyen en la generación de respuestas inmunes protectoras superiores en el huésped. Por lo anterior, en línea con las nuevas estrategias de diseño de vacunas anti-TB, nuestros hallazgos sugieren el uso de ctpA como blanco de atenuación en el desarrollo de cepas atenuadas de Mtb con potencial vacunal. (Texto tomado de la fuente).
Aproximación transcriptómica y fisiológica para el estudio de los mecanismos moleculares involucrados en la interacción clavel (Dianthus caryophyllus L.) – Fusarium oxysporum f. sp. dianthi
(Universidad Nacional de Colombia, 2022-10-07) Bustos Caro, Eliana; Ardila Barrantes, Harold Duban; Pinzon Velasco, Andrés Mauricio; Bustos Caro, Eliana [0009-0005-1248-6655]; Estudio de Actividades Metabolicas Vegetales
Vascular wilting caused by Fusarium oxysporum f. sp. dianthi (Fod) in carnations is undoubtedly one of the diseases with the greatest impact on the world flower sector. The molecular study of this plant-pathogen interaction will make it possible to propose new strategies for its early diagnosis and control in crops, and provide tools for the genetic design of varieties resistant to the pathogen. This study presents the first joint study of physiological parameters and comparative transcriptomics using RNAseq in this pathosystem. From the physiological approach, it was found that the mechanisms displayed by the plants of the resistant variety under study included stomatal closure without affecting the production of total chlorophyll, photochemical efficiency of photosystem II, or biomass production. Likewise, it was found that, at least in the varieties studied, leaf temperature can be postulated as an indicator for early diagnosis of the disease. On the other hand, the molecular mechanisms associated with resistance against Fod and displayed by the roots at early times include the activation of genes that code for potential RGA resistance proteins, oxidative burst, cell wall biogenesis, biosynthesis of specialized metabolites, chloroplast metabolism, and, in general, the transcriptional regulation related to stress response genes, defense response, and, to a lesser extent, some genes that participate in the response to osmotic stress, as well as some genes of hormonal pathways. In general, the transcriptional response, which was partially validated by RT-qPCR, is complex and shows components that are reported for the first time in the carnation response to the causal pathogen of vascular wilting.
Efecto de la restricción proteica como modulador de la respuesta inmune del Tracto gastrointestinal de ratones BALB/c infectados con Leishmania infantumntum
(Universidad Nacional de Colombia, 2022) Gaitán Albarracín, Felipe Andrés; Umaña Péres, Yadi Adriana; Grupo de Investigación en Hormonas
La desnutrición proteica es la causa más frecuente de inmunodeficiencia secundaria que conlleva a alteraciones del sistema inmune innato y adaptativo, generando la colonización y proliferación de agentes patogénicos, convirtiéndose en uno de los principales factores de riesgo para el desarrollo de formas clínicas de leishmania visceral (LV). Usando como modelo biológico ratones BALB/c, nuestro grupo de investigación mostró que animales sometidos a restricción proteica e infección con L. infantum, presentan graves atrofias en órganos linfoides, alteraciones en las subpoblaciones de linfocitos T y en niveles de expresión de factores quimiotácticos en timo y bazo. Esas alteraciones sugieren que una precondición de desnutrición proteica afecta la respuesta inmune frente a L. infantum, modificando la migración de células T y la capacidad de controlar la proliferación de parásitos. Aunque un patrón diseminación y respuesta inmune órgano especifica aún no ha sido claramente elucidado para el tracto gastrointestinal, algunos estudios reportan la aparición de estos parásitos en mucosa intestinal. Nuestro objetivo fue evaluar la influencia de la restricción proteica en la respuesta inmune en tracto gastrointestinal de ratones BALB/c frente a la infección con L. infantum, observando como la infección y desnutrición generaron alteraciones inmunes en función del reclutamiento linfocitario tisular, alteraciones estructurales del tejido intestinal y alteraciones en la respuesta inmune adaptativa celular mediada por citoquinas y humoral a través de la secreción de Inmunoglobulina A de forma diferencial para el intestino delgado y grueso. (Texto tomado de la fuente)
Caracterización bioquímica, funcional y biológica del veneno de Crotalus durissus cumanensis colombiana
(Universidad Nacional de Colombia, 2023) Rodríguez Vargas, Ariadna Lorena; Vega Castro, Nohora Angélica; Umaña Pérez, Yadi Adriana; RODRIGUEZ VARGAS, ARIADNA LORENA [0001378971]; Rodriguez Vargas, Ariadna [m3BS1-EAAAAJ&hl=es]; Rodríguez-Vargas Ariadna [000000016636987X]; Rodriguez Vargas Ariadna Lorena [Ariadna-Rodriguez-Vargas]; Grupo de Investigación en Proteinas Grip
En el veneno de serpientes cascabel predomina la actividad neurotóxica de las fosfolipasas tipo A2 (PLA2) y las miotoxinas de bajo peso molecular, además de los efectos hemocitotóxicos relacionados con proteasas. Se evaluaron las diferencias bioquímicas y biológicas en los venenos de Crotalus durissus cumanensis de tres ecorregiones de Colombia: Magdalena Medio (MM), Caribe (CA) y Orinoquía (OR). Se realizaron SDSPAGE y HPLC, letalidad, desfibrinación, procoagulación y actividades enzimáticas. Se realizó el reconocimiento de los antivenenos, mediante determinación de dosis efectiva (ED), Western blotting (WB) y ELISA. En los tres venenos, se encontraron proteasas y PLA2, incluida la subunidad básica de crotoxina. Solo se detectó crotamina en el veneno de CA. Hubo mayor letalidad, actividad coagulante, actividad fosfolipasa A2 y actividad hialuronidasa para el veneno de MM. Se encontraron diferencias en el reconocimiento de los antivenenos de uso comercial, colombiano y mexicano, por WB e inmunoafinidad. Existe variabilidad intraespecífica, considerando las diferencias en la abundancia e intensidad de los componentes, además de la actividad y respuesta a los antivenenos. La lectina tipo C (CTL) del veneno pudo ser aislada parcialmente y aparece unida a una serinoproteasa, al parecer por efecto de su glicosilación. Esta CTL mostró un efecto proliferativo sobre líneas celulares. Se purificó crotamina y se modeló su estructura tridimensional. Se demostró su efecto sobre la línea celular de cáncer de pulmón A549, mostrando un interesante efecto pro-apoptótico. Además, se hizo un docking molecular con una canal de potasio dependiente de voltaje, que también estaría involucrado en su efecto citotóxico. (Texto tomado de la fuente)
Estudio de la composición del hongo Lentinula edodes usando herramientas ómicas y su potencial en la producción de un alimento funcional
(Universidad Nacional de Colombia, 2021) Vega Oliveros, Carolina; Ardila Barrantes, Harold Duban; Chegwin Angarita, Carolina; Estudio de Actividades Metabolicas Vegetales; Química de Hongos Macromicetos Colombianos
Lentinula edodes es una especie fúngica perteneciente a los macromicetos para la cual se han reportado metabolitos y proteínas que presentan diversas actividades biológicas con potencial en la industria de alimentos. En la presente tesis doctoral se aporta al conocimiento bioquímico de este potencial, mediante la exploración química y el estudio de bioactividad presente en el micelio de esta especie obtenido mediante fermentación en estado líquido (FEL); estrategia de cultivo biotecnológico que permite la obtención eficiente de material biológico con fines industriales. Para ello inicialmente se determinaron algunos parámetros experimentales para su cultivo en condiciones de laboratorio y se seleccionaron dos medios que presentaron los mejores resultados en la producción de metabolitos y proteínas totales. Posteriormente usando ensayos de actividad biológica in vitro y estrategias propias de la proteómica y la metabolómica, se estudió la composición del micelio producido en dichos medios y se profundizó sobre sus potenciales características nutracéuticas. De acuerdo con los resultados encontrados en la presente investigación, el micelio producido mediante FEL en medios como GPY (Glucosa, Peptona y Levadura) y Bienestarina, presenta metabolitos y proteínas con potenciales usos en la industria de alimentos. Específicamente, el micelio obtenido en medio GPY mostró importante actividad antioxidante evaluada sobre EROs (especies reactivas de oxígeno) y ERN (especies reactivas de nitrógeno); muy posiblemente asociada a la presencia de diferentes compuestos hidroxilados, incluyendo un derivado de tipo flavanona. Así mismo, el micelio generado a partir del medio bienestarina contiene diversas proteínas con usos potenciales en la industria de alimentos, incluyendo algunas lectinas con reportada acción inmunomoduladora. El estudio preliminar de la incorporación del micelio obtenido en un alimento de tipo postre, permitió profundizar sobre el potencial del hongo propagado en GPY para ser usado en la generación de alimentos con potencial nutraceutico. La presente investigación profundiza sobre la bioquímica de la producción de metabolitos y proteínas en esta especie y se constituye como el primer estudio conjunto a nivel proteómico y metabolómico del potencial nutracéutico en macromicetos. (Texto tomado de la fuente)
Caracterización de la vía de señalización intracelular mediada por IGF2R en trofoblasto humano
(Universidad Nacional de Colombia, 2021-04-23) Castro Badilla, Juan José; Umaña Pérez, Yadi Adriana; Grupo de Investigación en Hormonas
El factor de crecimiento similar a la insulina tipo 2, IGF2, ejerce acciones a través de los receptores de la familia IGF incluyendo el receptor tipo 1 (IGF1R), el receptor de insulina (IR) y los híbridos IGF1R/IR. Preferentemente, su acción es mediada a través del receptor IGF1R modulando rutas de señalización intracelulares esenciales en procesos como la proliferación, migración o invasión celular, eventos que son de carácter crucial en las manifestaciones patológicas originadas en el trofoblasto, tales como la enfermedad trofoblástica gestacional, molas, preeclampsia o la restricción de crecimiento intrauterino, siendo estas complicaciones un problema actual para la salud pública del país. Se ha descrito que en tejido de mola la expresión de IGF2 se encuentra elevada y, además, que participa activamente en el proceso de la embriogénesis. La regulación de la biodisponibilidad de este ligando se atribuye, entre otros, a la unión con el receptor IGF2R, el cual lo internaliza para su degradación. Sin embargo, hace más de una década existe controversia sobre si esta interacción lGF2/IGF2R puede desencadenar una vía de señalización que participe en los procesos celulares descritos anteriormente. En este orden de ideas, para explorar si existe una vía de señalización dependiente de IGF2R, sin la activación directa de los otros receptores de la familia, se usó como estrategia estimular células derivadas de trofoblasto humano HTR-8/SVneo con Leu27IGF2, péptido análogo de IGF2, que se une exclusivamente al IGF2R. La inducción de las células con el análogo generó una activación temprana de las proteínas ERK1 y 2 mayor a la inducida por el IGF2. Se observó un incremento en los niveles de transcripción de MMP-9 de carácter tiempo-dependiente de Leu27IGF2 y anticipado con respecto al péptido IGF2, concordante con un aumento temprano de la actividad gelatinasa de MMP-9. Se determinó que la interacción de IGF2R con Leu27IGF2 generó un incremento significativo del 20%, 13% y 23% en adhesión, migración y proliferación celular respectivamente. Resultados que nos sugieren que el IGF2 en células de trofoblasto, activa al receptor IGF2R y al menos una ruta de señalización, como la de MAPKs, involucrada en el aumento de la activación de proteínas y transcripción de genes que favorecen la adhesión, migración e invasión celular durante la implantación blastocística. (Texto tomado de la fuente).
ATPasas tipo P2 como blancos para la atenuación de Mycobacterium tuberculosis.
(2021-04) Maya Hoyos, Milena; Soto Ospina, Carlos Yesid; Bioquímica y Biología Molecular de las Micobacterias
La tuberculosis (TB) es una enfermedad infecciosa causada por el bacilo ácido alcohol resistente Mycobacterium tuberculosis (Mtb). La TB es una amenaza para la salud pública, debido a su alta incidencia, la aparición de cepas multi-fármaco-resistentes (MDR) y extremadamente-fármaco-resistentes (XDR), la coinfección con VIH y la eficacia limitada de la vacuna BCG. El diseño de nuevas estrategias de control requiere una mejor comprensión de los mecanismos moleculares utilizados por Mtb para ser un patógeno intracelular tan exitoso. En este sentido, algunos estudios han sugerido la importancia de las ATPasas tipo P en la fisiología y la supervivencia intracelular de las micobacterias. Un meta-análisis del perfil transcripcional de las ATPasas tipo P de Mtb bajo condiciones de estrés como hipoxia, estrés oxidativo, inanición, intoxicación por agentes químicos y procesos de infección in vitro e in vivo, evidenció la expresión diferencial de estos transportadores frente a estas condiciones. De las 12 ATPasas tipo P presentes en el genoma de Mtb, CtpF, que codifica para un transportador de Ca2+, es la ATPasa que muestra mayores niveles de transcripción en las diferentes condiciones de estrés. Particularmente, varias ATPasas tipo P (ctpF, ctpG, ctpC, ctpH y ctpV) exhibieron un aumento en los niveles de expresión durante la infección de macrófagos humanos, sugiriendo la importancia de dichas proteínas en los procesos de infección. Considerando la relevancia funcional de las ATPasas tipo P, el objetivo principal de este trabajo fue evaluar el efecto de la deleción de ATPasas tipo P transportadoras de metales alcalino/alcalinotérreos en la viabilidad y virulencia de Mtb. Para lograr este objetivo, mediante técnicas de recombinería se construyeron los mutantes defectivos en los genes ctpF y ctpH de Mtb, y a partir de distintos análisis funcionales con las cepas mutantes, se demostró que ambos transportadores están implicados en el eflujo de Ca2+. Adicionalmente, las cepas mutantes (MtbΔctpF y MtbΔctpH) mostraron hipersensibilidad frente agentes oxidantes en comparación con la cepa tipo silvestre (MtbWT), indicando un vinculo entre el transporte de Ca2+ y los mecanismos que utiliza el bacilo para neutralizar especies reactivas del ambiente intrafagosomal. Por otro lado, se evaluó en un modelo celular y animal el efecto de la deleción del gen ctpF en la virulencia Mtb. Así, se evidenció que dicha mutación genera una disminución significativa en la capacidad replicativa de Mtb en macrófagos alveolares murinos de la línea celular MH-S. Asimismo, se comparó la virulencia de las cepas MtbΔctpF y MtbWT en un ensayo de sobrevida en ratones BALB/c, encontrando que los ratones infectados con la cepa mutante mostraban mayor tiempo medio de supervivencia, sugiriendo la atenuación de la cepa mutante. Finalmente, se comprobó la existencia de estrategias complementarias que permiten contrarrestar deficiencias en el transporte iónico mediado por las ATPasa tipo P en Mtb. En efecto, se encontró que la cepa MtbΔctpF sobreexpresa el gen ctpH frente a concentraciones tóxicas de Ca2+ y durante los procesos de infección in vitro. De manera similar, el mutante MtbΔctpH sobreexpresó el gen ctpF bajo condiciones tóxicas de Ca2+, sugiriendo una posible actividad compensatoria entre CtpF y CtpH en Mtb. En general, los resultados obtenidos en este trabajo demuestran que las Ca+2-ATPasas están involucradas en la respuesta frente sustancias tóxicas, siendo fundamentales para la supervivencia celular de Mtb. Además, CtpF es relevante para la proliferación intracelular, y su deleción genera atenuación del bacilo tuberculoso en un modelo experimental de TB pulmonar. De esta manera, CtpF es fundamental para la virulencia de Mtb, por lo que podría considerarse un interesante blanco de atenuación. (texto tomado de la fuente)
Evaluación in-vitro de péptidos sintéticos diseñados a partir de la Conantoquina G (Con-G) con interacción sobre la subunidad GluN2B del receptor de Glutamato tipo N-metil-D-aspartato (NMDAr) y su posible efecto sobre las vías de señalización involucradas en procesos de excitotoxicidad por calcio
(Universidad Nacional de Colombia, 2020-09-05) Vargas Alejo, Nury Esperanza; Reyes Montaño, Edgar Antonio; Soto Del Cerro, David; Grupo de Investigación en Proteinas - GRIP
Los receptores activados por el aminoácido glutamato de tipo N-metil-D-aspartato (NMDARs) son canales iónicos a través de los cuales fluyen iones calcio (Ca2+) hacia la neurona postsináptica, además de permear iones sodio (Na+) y potasio (K+) a su través. Los NMDARs juegan un papel importante en la plasticidad sináptica, permitiendo la inducción de la potenciación a largo plazo (LTP) y la depresión a largo plazo (LTD), las cuales suponen la base celular de la memoria y el aprendizaje (1). El NMDAR es un complejo proteico formado por cuatro subunidades que conforman un tetrámero (GluN1, GluN2 y GluN3), las cuales están fuertemente reguladas en la apertura y cierre del canal. Se ha demostrado que las subunidades proteícas que componen al NMDAR presentan diferentes combinaciones otorgándole propiedades estructurales y biofísicas específicas, lo anterior, ha permitido estudiarlo como una familia de receptores tipo N-metil-D-aspartato (NMDARs) (2). En este trabajo se han sintetizado y evaluado el efecto neuroprotector in-vitro de dos péptidos diseñados a partir de la secuencia de la Conantoquina-G (Con-G) denominados EAR-17 y EAR-19. En el diseño metodológico, la primera parte fue la síntesis en fase sólida de los péptidos, luego estos fueron caracterizados, purificados y finalmente, se realizó la determinación de la estructura secundaria. La caracterización electrofisiológica de los péptidos fue realizada en células tsA 201 (HEK293T) transfectadas dónde se determinó IC50 de los compuestos. La modulación de las corrientes excitatorias postsinápticas (EPSCs) producida por los péptidos fue testada en cultivos primarios de neuronas hipocampales de ratón. El efecto de neuroprotección de los péptidos se determinó mediante un modelo de deprivación de óxigeno-glucosa (OGD). El resultado del proceso de síntesis y purificación fue óptimo, obteniendo los péptidos puros. En la evaluación electrofisiológica se confirmó el efecto antagonista de los péptidos EAR-17 y EAR-19 sobre las corrientes mediadas por los NMDARs. En los registros de EPSCs, los péptidos disminuyeron las corrientes postsinápticas en neuronas hipocampales, sin recuperar la magnitud de corriente inicial de los EPSCs aunque su frecuencia no se vió alterada. Se determinó la neuroprotección mediada por los péptidos EAR-17 y EAR-19, en el modelo de OGD en neuronas hipocampales, el cual activa la vía de muerte celular por caspasas como consecuencia de la entrada irregular de calcio mediada por los NMDARs. Se observaron cambios significativos cuando la OGD se realizó en presencia y ausencia de los péptidos. Así pues, en este estudio, hemos identificado dos péptidos (denominados EAR-17 y EAR-19) que actúan como antagonistas específicos de la subunidad GluN2B del NMDAR y, por lo tanto, disminuyendo la permeabilidad al ion calcio e induciendo un efecto de neuroprotección. Sugerimos continuar la evaluación de EAR-17 y EAR-19 con otros enfoques in vitro e in vivo.
ATPasas tipo P de Mycobacterium tuberculosis como dianas para el diseño racional de compuestos antituberculosos
(2020-02-14) Santos Ruiz, Paola Andrea; Soto Ospina, Carlos Yesid; López Vallejo, Fabián Harvey; Bioquímica y Biología Molecular de las Micobacterias
Tuberculosis (TB) is an infectious disease caused by the acid-fast bacillus Mycobacterium tuberculosis (Mtb), which is one of the most important public health problems worldwide. Furthermore, the emergence of resistant Mtb strains to current anti-TB drugs has increased the search for alternative therapeutic targets and methods for the rational design of new effective drugs. In this sense, membrane proteins have been considered interesting targets due to their biological implication and for being highly accessible to active compounds. Particularly, P-type ATPases membrane transporters are interesting targets due to their implication in ionic homeostasis and mycobacterial viability. This work was oriented to CtpF, a calcium P-type ATPase, related to a broad number of biological conditions associated to processes of infection such as oxidative stress, adaptation of tubercle bacilli to anaerobic conditions, hypoxia and latency. Due to that, the main objective of this doctoral Thesis was to determine, through in silico and in vitro analysis, the potential of P-type ATPases of Mtb, especially the calcium transporter CtpF, as a target for the rational design of anti-TB compounds. Initially, a 3D homology model of CtpF was generated, which was employed for identified key pharmacophoric features of the CtpF-cyclopiazonic acid (CPA) complex, a well-known inhibitor of the sarco-endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA1a), from which its 3D structure is known experimentally and was used as a template in the construction of the model. By using a repertoire of experimental techniques, it was evaluated and found that CPA causes inhibition of the Ca2+-ATPase activity of CtpF, as well as mycobactericidal activity. The analysis of the transcriptional response of P2 ATPases to treatment with CPA showed a specific response of ctpF in comparison with other P-type ATPases. These initial results provide evidence that CtpF is a molecular target for the design of compounds with anti-TB potential. Thereupon, with the CtpF-CPA pharmacophoric features, a pharmacophore-based virtual screening was performed using the ZINC database in order to select candidate molecules to inhibitors of CtpF. Molecular docking-based virtual screening and binding free energy calculations (MM-GBSA) of selected candidates allowed identifying six compounds with the best relative binding energies to be evaluated in vitro. The compounds selected displayed in vitro antimycobacterial activity, showing a minimum inhibitory concentrations (MIC) ranging from 50 -100 μg/mL, and growth inhibitions of 29.5 - 64.0 % on Mtb. Likewise, they causes inhibition of Ca2+-ATPase activity in Mtb membrane vesicles (IC50) ranging from 4.1 - 35.8 μM. Finally, the activity of the compounds with the best biological activity was evaluated in a macrophage infection model, as an approach to evaluate the effect of compounds once the infection has occurred. The compound ZINC63908257 was the best candidate by displaying a MIC of 50 μg/mL, a Ca2+ P-type ATPase inhibition with IC50 = 4.4 μM and 81 % decrease in Mtb replication within macrophage. This compound showed cytotoxic activity of 12.9 % in MH-S cells and hemolysis of 2 % of human erythrocytes, thus, this compound shows a good pharmacokinetic profile (drug-like). Overall, the results presented here shows the importance of the P-type ATPases of Mtb for the mycobacteria survival during infection, and identify the CtpF as a key molecular target for the design of new antituberculous compounds.
Péptidos análogos a Catelicidinas: potencial actividad e interacción con la envoltura celular de las micobacterias
(2019-12) Chingaté López, Sandra Milena
La tuberculosis (TB) es la enfermedad bacteriana que causa el mayor número de muertes en todo el mundo. El problema se incrementa debido a la resistencia a medicamentos y a la coinfección por VIH/SIDA, por lo que es necesario el desarrollo de nuevos compuestos contra la TB que presenten diferentes mecanismos de acción. Los péptidos antimicrobianos son moléculas generadas en la respuesta inmune innata del hospedero con efecto sobre patógenos, como las catelicidinas presentes en mamíferos involucradas en la formación de canales en la membrana celular bacteriana que conduce a la lisis celular. En este estudio, se evaluó la actividad antimicobacteriana y el posible mecanismo de acción de péptidos derivados de LL-37, CAP-18 y PMAP-36 con aminoácidos no naturales. A partir de métodos bioinformáticos, se determinó la epítope de la secuencia nativa con las mejores características de estructura helicoidal, anfipaticidad y valor antibacteriano. Los péptidos correspondientes LL37-B, CAP18-B, CAP18-C, PMAP36-C y PMAP36-D tuvieron cambios de L-Lys por D-Lys y L-Gly por N-metil-Gly en la secuencia, generando los péptidos LL37-BD, CAP18-BD, CAP18-CD, PMAP36-CD y PMAP36-DD, y los peptoides LL37-BP, CAP18-BP y PMAP36-CP. Los péptidos y peptoides se sintetizaron usando la estrategia de Fmoc, se purificaron por RP-HPLC y se caracterizaron por ESI-MS, dicroísmo circular y H1-RMN. La evaluación in vitro de las secuencias diseñadas se realizó en Mycobacterium smegmatis mc2155 y Mycobacterium tuberculosis H37Ra, obteniendo una concentración mínima inhibitoria mejorada de 2 a 6 veces en los rangos de 1200 a 31,2 µg/mL, actividad hemolítica menor al 10% y sin actividad citotóxica sobre monocitos U937 con valores de LC50 al menos 10 veces mayores a la CMI. La microscopía confocal mostró la inserción de los péptidos y peptoides en Mycobacterium smegmatis mc2155 lo que sugiere que podrían tener un blanco intracelular para su actividad antimicobacteriana e interesantemente mostraron inhibición de la actividad ATPasa basal y de las bombas Na+/K+, Cu(I), Zn(II) presentes en la membrana plasmática, lo cual estaría asociado a su mecanismo de acción. En general, los péptidos con D-Lys presentaron mayor actividad biológica y sinergia en combinación con isoniacida y kanamicina, destacando los péptidos CAP18-CD y PMAP36-DD que presentaron los mejores resultados evaluados en Mycobacterium y células del hospedero, por lo cual, se analizaron mediante dinámica molecular, donde los ángulos promedio de psi y phi, así como su varianza circular muestran que ambos péptidos tienen una flexibilidad conformacional sustancial, característica muy importante para mejorar la actividad antibacteriana. Los resultados obtenidos contribuyen al campo de desarrollo de nuevos compuestos antituberculosos con un mecanismo de acción diferente a los medicamentos convencionales.
Contribución al estudio de los fenómenos bioquímicos y moleculares del apoplasto de clavel (Dianthus caryophyllus L) durante su interacción con Fusarium oxysporum f. sp. dianthi
(2019-06-14) Martinez Gonzalez, Ana Patricia
En esta investigación se abordó el estudio de algunos fenómenos bioquímicos y moleculares que ocurren en el apoplasto del clavel (Dianthus caryophyllus L) y que están asociados a la resistencia al marchitamiento vascular causado por el patógeno Fusarium oxsyporum f. sp. dianthi. Mediante una aproximación holística que incluyó la aplicación de herramientas propias de la proteómica y la metabolómica, se determinó cuales son las rutas metabólicas principales que se regulan a este nivel celular durante la expresión de resistencia. Para ello se pusieron a punto las condiciones tanto para la obtención del fluido apoplástico de raíces y tallos de clavel, como para el análisis a nivel de proteínas y metabolitos. Posteriormente, en dos variedades con niveles contrastantes de resistencia, se evaluaron las diferencias constitutivas e inducibles, a nivel del proteoma y metaboloma usando aproximaciones shotgun. Se determinó que la activación diferencial a este nivel depende del órgano involucrado en la interacción y que, dentro de las vías principales asociadas a los componentes activos y pasivos de la respuesta, se encuentran el metabolismo de carbohidratos, la regulación de especies reactivas de oxígeno y las respuestas de defensa y estrés. Dentro de estos procesos se encuentran proteínas relacionadas con patogénesis (PR), estrés oxidativo y regulación de especies reactivas de oxígeno (ROS), y degradación proteica como proteasas y peptidasas. Adicionalmente, se describe por primera vez, la presencia entre otros, de metabolitos apoplásticos asociados con la resistencia derivados de tipo fenólico que incluyen flavonoides y derivados de tipo fenalenonas. La validación de la regulación espacio temporal de estos fenómenos usando herramientas de análisis transcripcional como el RTqPCR, permitieron proponer puntos de regulación específicos que pueden estar asociados a la resistencia a la enfermedad, como es la expresión de ciertos genes de las familias de las proteínas PR. Se presentan por primera vez fenómenos bioquímicos asociados con el apoplasto que son postulados como probables marcadores de resistencia en este modelo planta-patógeno.
Estudio del efecto de lectinas vegetales sobre los procesos de migración y proliferación celular en queratinocitos epidérmicos
(2019-08-12) Cortázar Hernández, Tania Milena
Se estudiaron tres lectinas de la familia Fabacea (LDG-I y LDG-II de D. grandiflora, y LGL-II de G. lindenii), y se determinó su especificidad de unión y la influencia de ciertos glicotopes, así como de algunos residuos de azúcares circundantes en el reconocimiento de cada lectina, usando distintas glicoformas de O/N-glicoproteínas, eritrocitos de diferente perfil glicómico y a través del acople molecular in silico para la LGL-II. Se evaluó el efecto de las lectinas sobre los procesos de proliferación y migración celular en queratinocitos epidérmicos humanos; y se propuso un modelo de interacciones moleculares promovidas por las mismas. Las lectinas tipo II, i.e., LDG-II y LGL-II (con especificidades por cierto tipo de galactósidos y determinados glicotopes) mostraron efectos positivos sobre la proliferación y la migración en queratinocitos epidérmicos humanos; mientras que la lectina LDG-I (con especificidad por manósidos y otros glicotopes) mostró efecto positivo sobre la proliferación solo en la menor concentración usada e inhibió la migración en todas las condiciones probadas. La expresión del receptor de crecimiento epidérmico EGFR fosforilado se vió incrementada en lisados de queratinocitos cultivados en presencia de las lectinas tipo II; y se detectó un aumento en la concentración del factor EGF en los sobrenadantes de células cultivadas en presencia de LGL-II. Se observaron algunas similitudes en la especificidad de las lectinas tipo II hacia ligandos conocidos de la galectina-3 (LGALS3), lectina que tiene un papel en la reepitelización de la piel en mamíferos, y se plantean algunas semejanzas en los modelos propuestos de interacciones moleculares de las lectinas LDG-II y LGL-II, con las interacciones conocidas y predichas de la galectina LGALS3 con glicoconjugados celulares encontradas en bases de datos y en artículos publicados. Los resultados obtenidos, nos permiten tener como perspectiva la realización de estudios enfocadas a evaluar el efecto de las lectinas vegetales tipo II, en heridas de piel en modelo mamífero, y el uso potencial de alguna(s) de estas en tratamientos de curación de lesiones cutáneas en humanos, teniendo en cuenta sus efectos y sus especificidades de ligando.
Respuesta de las ATPasas tipo P1B a las condiciones de estrés en Mycobacterium tuberculosis
(2018-09-05) León Torres, Andrés Felipe
El éxito de Mycobacterium tuberculosis como patógeno se fundamenta en su capacidad de evadir la respuesta inmune del hospedero, sobreviviendo dentro de los macrófagos. En estas células, la micobacteria reside en fagosomas que exhiben una variedad de actividades antimicrobianas como pH ácido, especies reactivas de oxígeno (ROS) y nitrógeno (RNS), péptidos antimicrobianos, hidrolasas ácidas, bajo contenido de micronutrientes, y concentraciones no fisiológicas de iones de metales pesados. En este escenario hostil, los transportadores activos de cationes, como las ATPasas tipo P1B, juegan un papel relevante en la homeostasis iónica de la bacteria, al estar relacionados con la desintoxicación de estos metales, y con la respuesta al estrés redox. En el caso de M. tuberculosis, algunas ATPasas tipo P1B se han descrito como factores de virulencia, debido a su papel en la adaptación de la micobacteria al ambiente intracelular. En este orden de ideas, resulta interesante conocer la relación entre la actividad de las ATPasas tipo P1B y las condiciones de estrés que M. tuberculosis soporta durante la infección, con el fin de evaluar el potencial de estos transportadores de membrana en la viabilidad de M. tuberculosis. Para cumplir con este objetivo, el presente trabajo tuvo tres enfoques de estudio diferentes orientados a tener una visión del posible papel de las ATPasas tipo P1B en respuesta a algunas condiciones de estrés que simulan parcialmente el ambiente del fagosoma en el que reside M. tuberculosis. El primero, es el análisis transcripcional de las ATPasas tipo P1B bajo algunas condiciones de estrés al que M. tuberculosis se expone durante la infección. El segundo es la búsqueda de los posibles reguladores transcripcionales de estas ATPasas tipo P1B y la evaluación de su transcripción bajo las mismas condiciones de estrés, para así aproximarse a los potenciales mecanismos de regulación. Finalmente, una aproximación funcional de las tres Cu+ ATPasas putativas de M. tuberculosis, las que representan cerca de la mitad de ATPasas transportadoras de metales pesados en la micobacteria y cuya función se desconoce. Para su análisis se realizó una caracterización funcional de la actividad enzimática de estas tres proteínas, incluyendo análisis bioinformáticos, manipulaciones genéticas y de biología molecular, y finalmente un componente bioquímico para responder a los objetivos propuestos. Se encontró que todas las ATPasas tipo P1B de M. tuberculosis tienen una activación a nivel transcripcional en respuesta a las diferentes condiciones de estrés, como exposición a altas concentraciones de cationes de metales pesados, agentes de estrés oxidativo y nitrosativo, e hipoxia. El análisis transcripcional con cationes de metales pesados mostró que la transcripción de los genes ctpA, ctpG, y ctpV se activa en presencia de Cu2+, ctpC por Zn2+, ctpG por Cd2+ y ctpJ por Co2+. Agentes de estrés oxidativo y nitrosativo activaron la transcripción de los genes ctpA, ctpB, y ctpD, mientras que la hipoxia estimuló la expresión de ctpB y ctpC. Los anteriores resultados muestran que las ATPasas tipo P1B de M. tuberculosis se activan con la presencia de cationes de metales pesados, asociándose con el transporte estos metales y en su desintoxicación celular. También se pudo concluir que estas ATPasas se asocian con la respuesta al estrés redox e hipoxia, ayudando a la célula a responder a estas condiciones adversas. Los resultados del análisis transcripcional de los posibles reguladores transcripcionales de las ATPasas tipo P1B de M. tuberculosis, mostraron una respuesta concertada entre la activación de la transcripción del regulador y la ATPasa tipo P1B, lo que significa que los genes de los reguladores transcripcionales propuestos (rv0818, rv2250c, sigC, rv0324, sigH, rv0238, cmtR, nmtR, y csoR) aumentan sus niveles de expresión en respuesta a las mismas condiciones de estrés previamente establecidos para las ATPasas tipo P1B reguladas. Resulta interesante que M. tuberculosis exprese tres Cu+ ATPasas putativas, de las que se desconoce su función biológica. Nuestra hipótesis es que no se trata de sistemas redundantes de extrusión de cobre, sino que se trata de sistemas independientemente controlados que funcionan bajo condiciones metabólicas particulares de la micobacteria. Los análisis funcionales permitieron establecer que, cómo se esperaba, las tres enzimas tienen al Cu+ como sustrato. Los parámetros cinéticos de estas enzimas se determinaron usando ensayos enzimáticos de actividad Cu+ ATPasa y transporte de Cu+, permitiendo establecer que CtpA y CtpB se relacionan con enzimas encargadas de metalar proteínas extracitoplasmáticas, en tanto que CtpV se relaciona con la desintoxicación de Cu+, necesaria cuando los niveles de cobre intracelular sobrepasan el límite requerido y se vuelven deletéreos para la célula. El conjunto de resultados de este trabajo sugiere que las ATPasas tipo P1B de M. tuberculosis juegan un papel importante en la respuesta a las condiciones de estrés que la micobacteria enfrenta durante la infección, incluyendo altas concentraciones de metales pesados, estrés redox y bajas tensiones de oxígeno.
Identificación, aislamiento y caracterización bioquímica de péptido(s) con actividad citotóxica, presente(s) en el veneno de escorpión Tityus macrochirus (Buthidae)
(2017-11-17) Rincón Cortés, Clara Andrea
El veneno de escorpión ha sido objeto de estudio por varias décadas, dado en gran parte a los péptidos que lo conforman, ya que son los directamente responsables de los efectos tóxicos que desarrolla en sus presas o en otros organismos que entran en contacto con la sustancia. En Colombia hay gran diversidad de especies de escorpiones, pero pocas han sido estudiadas a nivel bioquímico, por lo cual se planteó realizar la caracterización estructural y funcional de péptidos del veneno de escorpión Tityus macrochirus, siendo el primer estudio realizado a nivel bioquímico de este veneno que se ha reportado. Así a partir de métodos bioquímicos, se logró identificar y determinar las características estructurales de la mayoría de los péptidos presentes en el veneno de T. macrochirus, definiéndolos como péptidos con pesos moleculares de 3 a 7 kDa, conformados de 37 a 70 residuos de aminoácidos, caracterizados porque en ellos se pueden encontrar entre 6 y 8 residuos de cisteína y algunos de ellos reconocen canales iónicos, como el canal de potasio que fue reconocido por el péptido denominado FVI8-2. Igualmente se logró determinar que tanto el veneno total como algunas de sus fracciones de péptidos generan citotoxicidad en líneas celulares provenientes de tumores de forma selectiva, en un rango de concentración de 0,25 µg/mL a 10 µg/mL. Estas características estructurales y funcionales permiten postular a algunos de estos péptidos como posibles agentes terapéuticos para el tratamiento de diferentes tipos de cáncer. Palabras clave: Tityus macrochirus, péptidos, canales iónicos, líneas celulares cancerosas, cáncer

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