Evaluación de un vector de transformación en p. fluorescens ibun S1602 para la producción de un copolímero de polihidroxialcanoatos (PHAs) de cadena corta (PHAscl) y cadena media (PHAmcl)

Abstract

Los Polihidroxialcanoatos (PHAs) son poliésteres acumulados intracelularmente como fuente de carbono y energía por bacterias en ciertas condiciones. Las características físicas y mecánicas del PHA depende del microorganismo usado, las proteínas, genes involucrados, las condiciones de crecimiento, la ruta metabólica y la fuente de carbono suministrada. Por ejemplo, los copolímeros de cadena corta y media exhiben características como, una temperatura de fusión más baja, un módulo de Young más bajo y un alargamiento de rotura más alto, esto significa que es un plástico más resistente y flexible. El Grupo de Investigación de Bioprocesos y Bioprospección de la Universidad Nacional (UNAL) ha enfocado sus esfuerzos en el estudio de microorganismos con potencial biotecnológico para establecer un aprovechamiento sostenible y rentable de bio-productos de interés comercial. Pseudomonas fluorescens y Burkholderia acumulan PHAs de cadena media (PHAmcl) y cadena corta (PHAscl) respectivamente, a partir de diversas fuentes de carbono y han sido objeto de estudio en el grupo de investigación. Análisis genéticos realizados por el grupo han demostrado que la especie P. fluorescens IBUN S1602 contiene la polimerasa tipo II para producción de PHAmcl, no obstante, hasta la fecha el grupo no ha hecho un reporte parecido para Burkholderia sp. IBUN 2G57. Dentro del trabajo realizado con IBUN S1602 se recomendó para futuras investigaciones establecer las condiciones de fermentación para producir PHAs e iniciar la manipulación genética usando el conocimiento de los genes involucrados en la producción de PHAmcl. El objetivo de este trabajo es aprovechar los recursos genéticos de Pseudomonas y Burkholderia para producir PHAs de cadena corta y media que podrían ser considerados más competitivos en el mercado y que suplieran las necesidades y limitaciones de la obtención de estos biopolímeros. En el desarrollo del proyecto se estandarizaron las condiciones de PCR de cinco pares de cebadores para amplificar el operón phaCAB y los genes phaC, phaA, phaB de Burkholderia sp. IBUN 2G57 involucrados en la producción de PHB (poli-3-Hidroxibutirato), se determinó que esta cepa tiene la organización genética de la sintasa tipo I al igual que la cepa más estudiada Cupriavidus necator, a su vez, se diseñó un vector de transformación con el operón phaCAB y el gen phaC y se realizaron ensayos de transformación de P. fluorescens IBUN S1602. La evaluación del vector de transformación construido en este trabajo llevó a considerar que los insertos provenientes de las cepas de Burkholderia presentaban un grado de toxicidad que impedían la exitosa transformación de IBUN S1602. (Texto tomado de la fuente)

Polyhydroxyalkanoates (PHAs) are polyesters accumulated intracellularly as a carbon and energy source by bacteria under certain conditions. The physical and mechanical characteristics of PHA depends on the microorganism used, the proteins, genes involved, the growth conditions, the metabolic pathway and the carbon source supplied. For example, short and medium chain copolymers exhibit characteristics such as, lower melting temperature, lower Young's modulus, and higher elongation at break, this means that it is a stronger and more flexible plastic, leading to improved bioplastic properties. The Bioprocesses and Bioprospecting Research Group of the National University (UNAL) has focused its efforts on the study of microorganisms with biotechnological potential with the objective of establishing a sustainable and profitable use of bio-products of commercial interest. Pseudomonas fluorescens and Burkholderia are microorganisms that accumulate medium-chain PHAs (PHAmcl) and short-chain PHAs (PHAscl) respectively, using diverse carbon sources and have been the object of study in the research group. Genetic analyses performed by the group have shown that P. fluorescens IBUN S1602 contains the type II polymerase for PHAmcl production, however, to date the group has not made a similar report for Burkholderia sp. IBUN 2G57. Within the work carried out with IBUN S1602, it was recommended for future research to establish fermentation conditions for this strain and to initiate genetic manipulation taking advantage of the knowledge of the genes involved in PHAmcl production. The objective of this work is to take advantage of the genetic resources of Pseudomonas and Burkholderia to produce short- and medium-chain PHAs that could be considered more competitive in the market and that would meet the needs and limitations of obtaining these biopolymers. In the development of the project, the PCR conditions of five pairs of primers were optimized to amplify the pha operon and the phaC, phaA, phaB genes of Burkholderia sp. IBUN 2G57 involved in the production of PHB (poly-3-Hydroxybutyrate), it was determined that this strain has the genetic organization of type I synthase like the most studied strain Cupriavidus necator, in turn, a transformation vector with the pha operon and phaC gene was designed and transformation assays of P. fluorescens IBUN S1602 were performed. The evaluation of the transformation vector constructed in this work led to consider that the inserts from the Burkholderia strains presented a degree of toxicity that prevented the successful transformation of IBUN S1602.