Expresión y caracterización funcional de una ADN polimerasa I de Geobacillus stearothermophilus

Abstract

La ADN polimerasa de Geobacillus stearothermophilus (ADN Pol I Bst), es un miembro de la familia A de las polimerasas, que posee características desplazamiento de hebra que favorecen su aplicación en métodos de amplificación isotérmica. En el presente trabajo se describe la expresión y caracterización funcional de una ADN Pol I Bst, iniciando por la secuenciación del plásmido mediante tecnología Oxford Nanopore, para confirmar la secuencia codificante de la proteína, seguido de un análisis in sillico, con el propósito de determinar la estructura 3D y sitios activos de la proteína. Posteriormente, se realizó la expresión, extracción, purificación, determinación de la actividad catalítica y análisis de funcionalidad mediante Loop Mediated Isothermal Amplification (LAMP) a 65 °C por 60 min, utilizando cómo sustrato ARN de SARS-CoV-2. Los resultados reflejan una secuencia codificante de 576 aminoácidos que pertenece al fragmento grande de ADN Pol I Bst, el cual tiene peso molecular de 61,8 kDa. Se obtuvo una concentración de 2mg/ml de proteína total, que posee una actividad enzimática de 606.4 U y una actividad especifica de 3.0×105 U/mg. Finalmente, se demuestra que la proteína es funcional al amplificar una secuencia perteneciente al Orf1a de ARN de SARS-CoV-2. Aquí se presenta una proteína funcional, con libertad de operación para su distribución y que es aplicable a sistemas de amplificación isotérmica para el diagnóstico de enfermedades de importancia clínica (Texto tomado de la fuente).

The DNA polymerase from Geobacillus stearothermophilus (Bst DNA Pol I) is a member of the A family of polymerases, exhibiting strand displacement characteristics that favor its application in isothermal amplification methods. This study describes the expression and functional characterization of a Bst DNA Pol I, starting with plasmid sequencing using Oxford Nanopore technology to confirm the protein's coding sequence. This is followed by in silico analysis to determine the protein's 3D structure and active sites. Subsequently, expression, extraction, purification, determination of catalytic activity, and functionality analysis were performed using Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) at 65 °C for 60 min, with SARS-CoV-2 RNA as the substrate. The results reveal a coding sequence of 576 amino acids belonging to the large fragment of Bst DNA Pol I, with a molecular weight of 61.8 kDa. A protein concentration of 2 mg/ml was obtained, exhibiting enzymatic activity of 606.4 U and a specific activity of 3.0×105 U/mg. Finally, it is demonstrated that the protein is functional in amplifying a sequence belonging to the Orf1a of SARS-CoV-2 RNA. While optimization studies are important to enhance the protein production process, this study presents a functional protein with operational freedom for distribution and applicability in isothermal amplification systems for the diagnosis of clinically significant diseases.