Desarrollo de herramientas moleculares para la implementación del sistema CRISPR-Cas9 en Leishmania braziliensis

Abstract

Las Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente Interespaciadas (CRISPR) junto con sus proteínas asociadas (Cas), constituyen un sistema de defensa adaptativo procariota para contrarrestar infecciones virales. El sistema se ha aprovechado como una herramienta de edición génica programable, posibilitando diversos estudios y aplicaciones biotecnológicas, incluyendo la edición génica de organismos patogénicos como Leishmania y Trypanosoma. En Leishmania, el sistema CRISPR-Cas9 ha permitido caracterizar diversos genes de virulencia, así como la obtención de parásitos atenuados con potencial vacunal. Sin embargo, su implementación aún no ha sido reportada para este parásito en Colombia. El presente trabajó abordó el desarrollo de herramientas relacionadas con la implementación del sistema CRISPR-Cas9 en L. braziliensis, una de las especies circulantes en nuestro país. Específicamente, se emprendió la producción de anticuerpos policlonales aviares (IgY) anti-SpCas9, utilizando como antígeno la proteína Cas9 recombinante de Streptococcus pyogenes (SpCas9-6xHis). Estos anticuerpos resultaron ser sensibles, específicos y útiles para inmunodetectar la proteína SpCas9 en promastigotes de L. braziliensis transfectados con el plásmido pTB007 Viannia, el cual codifica para esta proteína. Adicionalmente, se abordó la expresión y purificación de la enzima T7 RNA Polimerasa (6xHis-T7RNAP) desde Escherichia coli, resultando útil para sintetizar ARN guías (sgRNA) y preparar complejos ribonucleoproteicos (SpCas9-sgRNA) funcionales, capaces de efectuar cortes de ADN in vitro. Por último, se implementó el sistema CRISPR-Cas9 para realizar edición génica sobre la nicotinamida mononucleótido adenililtransferasa de L. braziliensis (LbNMNAT), que participa en la síntesis del NAD, insertando la secuencia CfPGKB5’-mCherry en el extremo 5’ del gen de interés en parásitos que expresan SpCas9 y T7RNAP. Los análisis funcionales del gen revelaron un aumento de sus niveles de expresión, mientras que los ensayos de susceptibilidad ante estrés oxidativo mostraron mayores valores IC50 en los parásitos editados en comparación con muestras control, lo que sugiere que la síntesis del NAD puede estar relacionada con fenotipos fármaco-resistentes. De esta manera, se obtuvieron herramientas que facilitan la implementación del sistema CRISPR-Cas9 en L. braziliensis, un patógeno de interés para la salud pública del país. Así mismo, se demostró la posibilidad de aprovechar sistemas avanzados de biología molecular para estudiar genes relacionados con la síntesis del NAD en el contexto de enfermedades tropicales desatendidas como la Leishmaniasis (Texto tomado de la fuente).

Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) and their associated proteins (Cas), constitute a prokaryotic adaptive defense system to counter viral infections. The system has been harnessed as a programmable gene-editing tool, enabling diverse biotechnological studies and applications, including gene editing of pathogenic organisms such as Leishmania and Trypanosoma. In Leishmania, the CRISPR-Cas9 system has made it possible to characterize several virulence genes and obtain attenuated parasites with vaccine potential. However, its implementation has not yet been reported for this parasite in Colombia. In this sense, the present work addressed the development of tools related to implementing the CRISPR-Cas9 system in L. braziliensis, one of the species circulating in our country. Specifically, the production of anti-SpCas9 avian polyclonal antibodies (IgY) was undertaken, using the recombinant Cas9 protein from Streptococcus pyogenes (SpCas9-6xHis) as antigen. The antibodies were sensitive, specific, and useful to immunodetect SpCas9 protein in L. braziliensis promastigotes transfected with plasmid pTB007 Viannia, which encodes for this protein. Additionally, the expression and purification of the enzyme T7 RNA Polymerase (6xHis-T7RNAP) from Escherichia coli were addressed, proving useful for synthesizing guide RNA (sgRNA) and preparing functional ribonucleoprotein complexes (SpCas9-sgRNA), capable of performing in vitro DNA cleavage. Finally, the gene coding for the L. braziliensis nicotinamide mononucleotide adenylyltransferase (LbNMNAT), which is involved in NAD synthesis, was targeted for editing. Using parasites expressing SpCas9 and T7RNAP proteins, the sequence CfPGKB5'-mCherry was inserted at the 5' end of the gene of interest, favoring the increase of LbNMNAT expression levels. Phenotypic assays of susceptibility to oxidative stress revealed higher IC50 values in the edited parasites compared to control samples, suggesting that NAD synthesis is related to drug tolerance. In this way, several tools were obtained that facilitate the implementation of the CRISPR-Cas9 system in L. braziliensis, a pathogen of public health interest in Colombia, demonstrating the possibility of taking advantage of advanced molecular biology systems to study genes related to NAD synthesis in the context of neglected tropical diseases such as Leishmaniasis.