Efecto de scaffold de fibrina y suplementos séricos, sobre la proliferación de células madre mesenquimales y su diferenciación a osteoblastos in vitro

Abstract

Resumen Objetivo Evaluar el cultivo en el scaffold de fibrina (S-FBR) y con los suplementos séricos de plasma rico en factores de crecimiento (PRGF) y suero fetal bovino (SFB), sobre la proliferación de células madre mesenquimales de cordón umbilical humano (hUCMSC) y su potencial de diferenciación a osteoblastos. Materiales y métodos: para evaluar el efecto del S-FBR sobre la cinética de proliferación de una línea celular de hUCMSC, con el sangrado periférico de 3 voluntarios masculinos sanos entre 20 -30 años, obteniendo el S-FBR con un protocolo de centrifugado determinado (primera centrifugación a 450 xg por 5 minutos, se sustrajo el plasma inmediatamente por encima de la capa del buffy coat y debajo del plasma pobre en plaquetas; con este plasma se realiza un segundo centrifugado a 1400 xg por 5 minutos, al plasma resultante se le adicionó cloruro de calcio (CaCl₂) a 50 mM según volumen del pozo) y adicionando el suplemento de PRGF 10% (obtenido con la muestra sanguínea de los donantes, centrifugando inicialmente a 580xg por 10 min, se sustrajo el plasma de los 3 voluntarios y se hizo un pool de PRP, que se centrifugó nuevamente a 1400 xg, 10 min. se le agregó gluconato de calcio (0,5 ml/10ml de PRP) según volumen del pozo y luego se le realizaron 4 ciclos de congelamiento y descongelamiento de 37°C a -20 °C para generar lisis plaquetaria, agregando al medio (DMEM) una concentración de PRGF 10%) y suplemento de FBS 10%. Se generaron 5 grupos de estudio 1. S-FBR+ PRGF. 2. S-FBR + FBS. 3. S-FBR. 4. PRGF 10% y 5. FBS 10%. En cada uno de ellos se sembró por pozo 10.000 hUCMSC caracterizadas. Se evaluó inicialmente, por grupo experimental la proliferación, nivel de duplicación y tiempo de generación, a las 24h y 48h con MTT (absorbancia de 570nm). Luego en los 5 grupos de estudio, se observó la diferenciación de las hUCMSC a osteoblastos por 21 días, identificando los centros de calcificación temprana con tinción de alizarina roja, Von Kossa, SEM (scanning electron microscope) y su composición por EDS (energy-dispersive X-ray spectroscopy). Resultados: El porcentaje de proliferación de la hUCMSC de mayor a menor valor en los grupos de estudio a las 24 h. fue: S-FBR (363,6 % ± 48,19), S-FBR + FBS (261,64% ± 83,10), PRFG (190,5 % ± 14,5), S-FBR + PRGF (177,93% ± 46,93) y FBS (92,82% ± 14,46); no se presentó diferencia estadística significativa entre los grupos S-FBR + PRGF vs. PRGF, entre los demás sí la hubo (P < 0,05). El porcentaje de proliferación a las 48 h. fue: S-FBR (494,46 % ± 88,38), S-FBR + FBS (349,27% ± 112,34), PRGF (261,97% ± 24,28), FBS (178,61% ± 37,04) y S-FBR + PRGF (137,07% ± 82,03), no se presentó diferencia estadística significativa entre los grupos S-FBR + PRGF vs. FBS y S-FBR + FBS vs. PRGF, entre los demás si la hubo. El grupo S-FBR tuvo el mejor nivel de duplicación, a las 24h (2,21 ± 0,15), con diferencia estadística significativa vs. los demás grupos de estudio, y a las 48 h. (2,48 ± 0,41), no presentó diferencia significativa con el grupo S-FBR + FBS (P > 0,05). En cuanto al tiempo de generación, el grupo S-FBR tuvo los menores tiempos de generación, a las 24h.:10,91 ± 0,80 con diferencia estadística significativa comparado con los demás grupos, y a las 48 h. 20,10 ± 5,15, tiempo en el que no se dio diferencia significativa con el grupo S-FBR + FBS, con los demás grupos experimentales si hubo (P >0,05). Se confirmaron centros de osificación por tinción de alizarina roja y Von Kossa además por SEM y EDS en los grupos S-FBR, S-FBR + FBS y S-FBS + PRGF. Conclusiones: el S-FBR tiene un mejor efecto sobre la proliferación de células madre mesenquimales y sostiene su estímulo hasta los 21 días durante el periodo de diferenciación a osteoblastos. El S-FBR + PRGF y S-FBR + FBS también lograron un buen estímulo sobre la cinética celular. (texto tomado de la fuente)

Objective: To evaluate the effect of culture in fibrin scaffold (S-FBR) and with serum supplements of plasma rich in growth factors (PRGF) and fetal bovine serum (FBS) on the proliferation of human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUCMSC) and their differentiation potential into osteoblasts. Materials and methods: to evaluate the effect of S-FBR on the proliferation kinetics of a hUCMSC cell line, with peripheral bleeding from 3 healthy male volunteers between 20 -30 years old, obtaining the S-FBR with a specific centrifugation protocol (first centrifugation at 450 xg for 5 minutes, the plasma was removed immediately above the buffy coat layer and below the platelet-poor plasma; with this plasma a second centrifugation was performed at 1400 xg for 5 minutes, to the resulting plasma calcium chloride (CaCl₂) was added at 50 mM according to the volume of the well) and adding the PRGF 10% supplement (obtained from the blood sample of the donors, initially centrifuged at 580xg for 10 min, the plasma was removed from the 3 volunteers and a PRP pool was made, which was centrifuged again at 1400 xg, 10 min. calcium gluconate (0.5 ml/10 ml of PRP) depending on the volume of the well and then 4 cycles of freezing and thawing were performed from 37 ° C to -20 ° C to generate platelet lysis, adding a concentration of 10% PRGF to the medium (DMEM) and a 10% FBS supplement. 5 study groups were generated: 1. S-FBR + PRGF. 2. S-FBR + FBS. 3. S-FBR. 4. SCLP 10% and 5. FBS 10%. In each of them, 10,000 characterized hUCMSCs were seeded per well. Proliferation, duplication level and generation time were initially evaluated per experimental group at 24h and 48h with MTT (absorbance of 570nm). Then, in the 5 study groups, the differentiation of hUCMSCs into osteoblasts will be observed for 21 days, identifying the early calcification centers with alizarin red staining, Von Kossa, SEM (scanning electron microscope) and their composition by EDS (energy dispersive X-ray spectroscopy). Results: The percentage of hUCMSC proliferation from highest to lowest value in the study groups at 24 h was: S-FBR (363.6% ± 48.19), S-FBR + FBS (261.64% ± 83.10), PRFG (190.5% ± 14.5), S-FBR + PRGF (177.93% ± 46.93) and FBS (92.82% ± 14.46); there was no significant statistical difference between the S-FBR + PRGF vs. PRGF groups, but there was a significant difference among the other groups (P < 0.05). The percentage of proliferation at 48 h. was: S-FBR (494.46% ± 88.38), S-FBR + FBS (349.27% ± 112.34), PRGF (261.97% ± 24.28), FBS (178.61% ± 37.04) and S-FBR + PRGF (137.07% ± 82.03), there was no significant statistical difference between the S-FBR + PRGF vs. FBS and S-FBR + FBS vs. PRGF groups, among the others there was. The S-FBR group had the best level of duplication, at 24h (2.21 ± 0.15), with a significant statistical difference vs. the other study groups, and at 48h. (2.48 ± 0.41), did not present significant differences with the S-FBR + FBS group (P > 0.05). Regarding the generation time, the S-FBR group had the lowest generation times, at 24h: 10.91 ± 0.80 with a significant statistical difference compared to the other groups, and at 48h. 20.10 ± 5.15, a time in which there was no significant difference with the S-FBR + FBS group, with the other experimental groups there was (P > 0.05). Ossification centers were confirmed by alizarin red and Von Kossa staining, as well as by SEM and EDS in the S-FBR, S-FBR + FBS and S-FBS + PRGF groups. Conclusions: S-FBR has a better effect on the proliferation of mesenchymal stem cells and maintains its stimulation up to 21 days during the differentiation period to osteoblasts. S-FBR + PRGF and S-FBR + FBS also achieved good stimulation of cell kinetics.